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mRNAかtotalRNAか、RNaseHの必要性 トピック削除
No.1609-TOPIC - 2013/04/05 (金) 09:18:18 - こち
よろしく御願いします。

哺乳動物の組織からRNA iso plusで抽出したtotal RNAを材料に、RT-PCRでクローニング用のインサート(約1500bp)を得ようとしています。

手元にあったリアルタイムPCR用の東洋紡ReverTra Ace qPCR RT Master mix with gDNA removerで作成したcDNAを使って、PCRをしてみましたが、増幅産物を得る事ができませんでした(300bp程度のPCRのためには使えたのですが)。

そこでタカラバイオのPrimeScriptIIなどのクローニング用らしいcDNA合成キットを購入してやり直そうと考えています。このような目的の場合、oligotex dTなどでmRNAを精製してからcDNA合成すべきでしょうか?それともtotal RNAでもcDNA合成してよいでしょうか?

またcDNA合成後には、RNaseH処理が必要でしょうか?

それから、もし、ReverTra Ace qPCR RT Master mixを1500bpのPCR増幅産物をクローニングする目的のための前段としての、組織由来total RNAからのcDNA合成に使用するノウハウをご存知の方は、注意点を教えてください(例えば反応時間を15分から30分に延長する、遺伝子特異的プライマーを用いるな ど)。

よろしくお願いします。
 
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(無題) 削除/引用
No.1609-12 - 2013/04/06 (土) 16:59:17 - こち
ありがとうございます。

オリゴdtのみでのcDNA合成に平行して、5種類のスペシフィックプライマーを組み合わせた3種類のcDNA合成(5x3=15)を実施してみようと考えています。

(無題) 削除/引用
No.1609-11 - 2013/04/06 (土) 13:03:31 - おお
オリゴdtとランダムプライまー抜きでやってきださい。スペシフィックプライまーを数種類組み合わせる事はかのうかとおもいます。さすがに15個全部というのはどうなるかわかりませんけど、やってみる価値はあると思います。それで拾えなかったものだけで違うストラテジーを立てるのもてかとおもいます。

(無題) 削除/引用
No.1609-10 - 2013/04/06 (土) 12:46:42 - こち
様々な御意見をありがとうございます。

もうひとつ皆様の御経験を教えてください。

cDNA合成の際に、ランダム6merとオリゴdTの両方を用いた事になります。これに遺伝子特異的なプライマーを追加して用いるメリットはあるでしょうか?

当方の計画では、ひとつのcDNA合成反応液から、15種類のクローニング用のインサートを得ようとしています(15種類の遺伝子はファミリーです)。そのため遺伝子特異的なプライマーを追加した方が良い場合には、RNA溶液を15等分して、別々にcDNA合成をする必要が生じます。

(無題) 削除/引用
No.1609-9 - 2013/04/06 (土) 11:12:33 - -
訂正ですが、先ほどのプライマー云々はreverse-transciption後のPCRの話です(お分かりだったと思いますが、念のため訂正しておきます)。

私は、東洋紡ReverTra Ace qPCR RT Master mix (gDNA removerが入ってないもの)を使用していますが、反応時間15分で、3kbpまでのcDNAは問題なくクローニングできております。

RT反応の酵素を変えてもクローニングしたい産物の絶対量が少なければ、クローニングすることは難しいと思います。また、量が十分あるとしても、PCR酵素との相性もあると思います。これらの際には、PCR酵素の変更やnested PCRの検討も必要かと思います。

本題からそれましたので、この辺で失礼します。

(無題) 削除/引用
No.1609-8 - 2013/04/06 (土) 00:21:52 - おお
>[Re:6] こちさんは書きました :
> 御意見をありがとうございます。

> しかし、手元にある組織量、次のステップに進むための時間、などを考えてて、おおさんの話のSuperscriptIIIを買う事にしました。
>
> 正直、SuperscriptIIIのキットは50回分で6万円以上なので高すぎです。もしタカラなどの国産品で、長年の実績で評判の良いものがあるならば、と買いたいです

さいきんはcDNA作成用きっととして全部込みで売られていたりするようですが、オリゴdTがあるなら酵素を単品で買えばいいかと思います(バッファー、DTTは酵素についてきます)。dNTPmixは別だったかもしれませんけど、別にメーカーを気にしなくてもいいかと思いますので、TOYOBOでも日本ジーンでもどこでもいいでしょう。

(無題) 削除/引用
No.1609-7 - 2013/04/06 (土) 00:02:30 - cDNA
メーカーとのやり取りにメーカーのやる気のなさを感じるので、不思議な気分です。

私のいるラボではReverTra Aceを基本の逆転写酵素として使っています。1.5kbのクローニングは問題なく出来ていますので、特に難しい長さではなく、酵素に問題があるとは感じません。

ただ、お使いのキットはオリゴが混合されたマスターmixになっていて、Origo dTとランダムプライマーが混ざっているようですね。だから反応時間の延長を勧めないのでしょうが、それならReverTra Ace単体の購入を勧めるのが普通の営業姿勢だと思います。

Origo dTに特定配列を付けても各社の定額オリゴか高くても2000円ぐらいで買えると思いますが、これとReverTra Aceで2万円あれば購入可能です。購入予定のキットにはRNase Hが付いているようなのでこの値段もアップしますね。それよりはDNase使った方がいいと思います。

ちなみに私のラボでは逆転写反応は42℃1.5時間が慣例になっています。説明書では30分ですが、比べたことが無いので、1.5時間に意味があるかどうか分かりません。

Origo dTではなく特異的なプライマーを使えばより確実に目的配列を増やしやすいcDNAが作れるでしょう。total RNAかどうかについては生物種、組織によるので確実なことは言えませんが、total RNAで問題ないケースは多いと思います。

更に言うなら同じcDNAでもPCRに使う酵素で増える増えないの差が出ることも珍しことではありません。もっと意地悪なこと言うと、1.5kbpで既知配列なら合成遺伝子でも6万ともう少し出せば購入可能です。

(無題) 削除/引用
No.1609-6 - 2013/04/05 (金) 22:02:28 - こち
御意見をありがとうございます。


RT-PCRのプライマーのポジションを変えたり、長くしてみる、あるいは、全長だけでなく半部づつで増やしてみるというのも、ありえる事だと思います。

しかし、手元にある組織量、次のステップに進むための時間、などを考えてて、おおさんの話のSuperscriptIIIを買う事にしました。

正直、SuperscriptIIIのキットは50回分で6万円以上なので高すぎです。もしタカラなどの国産品で、長年の実績で評判の良いものがあるならば、と買いたいです

(無題) 削除/引用
No.1609-5 - 2013/04/05 (金) 19:38:29 - -
実験の詳細な部分は書かれてないのでわかりませんが、東洋紡の酵素のままで、RT-PCRのプライマーのポジションを変えたり、長くしてみる、あるいは、全長だけでなく半部づつで増やしてみるというのはだめなのでしょうか?プライマーをいじる方が手間も少ないですし、コストも抑えられると思いますが。

(無題) 削除/引用
No.1609-4 - 2013/04/05 (金) 12:58:52 - おお
side by sideで確かめたことがないのでどちらがよいとは言いにくいですが、すくなくともIIIが同程度以上というのが感触です。

理論的にはIIIの方がいいとは思います。特に高温で使用した場合。

RNaseH処理の代わりにNaOHをつかって一本さDNAを得る方法もありますが、知っているだけでやったことはありません。

(無題) 削除/引用
No.1609-3 - 2013/04/05 (金) 12:29:39 - こち
おお様

早速の御意見をありがとうございます。

=RT産物が長いRNAからのRTPCRに使えないと判断したのはなぜですか。

不確かなので、先程メーカーにも聞きました。回答は、Buffer組成の改良も含め1000bp以下のcDNA合成に最適化してあり、そのため、ターゲット長が1000bpの場合はほとんど影響はないかもしれないが、ターゲット長が1500bpの場合はPCR産物が得られても増幅量が減ったりエキストラバンドがでやすくなる可能性がある、という事でした。

また、逆転写反応時間に関しては、15分を延長する必要はないのではないかと思われます、という事でした。

oligotexdTや、RNaseH処理は、コストの理由で省略できるなら省略したいです。無くても大丈夫!という御意見を期待していましたが、皆様、悩みながら取捨選択をされているのでしょうね(?)

Superscriptをお使いという事ですが、IIとIIIがあるようです。どちらをお使いでしょうか?

次の頁をみていると、高温のcDNA合成キットの方が良いような気がしてきました。

https://ja.invitrogen.com/site/jp/ja/home/Products-and-Services/Applications/PCR/reverse-transcription/reverse-transcriptase-enzymes.html

(無題) 削除/引用
No.1609-2 - 2013/04/05 (金) 10:36:34 - おお
>[Re:1] こちさんは書きました :
> よろしく御願いします。
>
> 哺乳動物の組織からRNA iso plusで抽出したtotal RNAを材料に、RT-PCRでクローニング用のインサート(約1500bp)を得ようとしています。
>
> 手元にあったリアルタイムPCR用の東洋紡ReverTra Ace qPCR RT Master mix with gDNA removerで作成したcDNAを使って、PCRをしてみましたが、増幅産物を得る事ができませんでした(300bp程度のPCRのためには使えたのですが)。

RT産物が長いRNAからのRTPCRに使えないと判断したのはなぜですか。

>
> そこでタカラバイオのPrimeScriptIIなどのクローニング用らしいcDNA合成キットを購入してやり直そうと考えています。このような目的の場合、oligotex dTなどでmRNAを精製してからcDNA合成すべきでしょうか?それともtotal RNAでもcDNA合成してよいでしょうか?

mRNAの方がターゲットが濃縮されてますよね。

>
> またcDNA合成後には、RNaseH処理が必要でしょうか?

することによってPCRのかかり方が大きく変わることもたまにあります。


>
> それから、もし、ReverTra Ace qPCR RT Master mixを1500bpのPCR増幅産物をクローニングする目的のための前段としての、組織由来total RNAからのcDNA合成に使用するノウハウをご存知の方は、注意点を教えてください(例えば反応時間を15分から30分に延長する、遺伝子特異的プライマーを用いるな ど)。

スーパースクリプトをよく使いますが、1から2時間は反応させてますけど、、、長い方がいいとはおもいますが、その酵素については詳しくはありません。特異的なプライマーの方がサンプルのDNAの複雑性が減りますのでPCRには有利だと思いますが、そのプライマーがRTに働いているか評価が難しいというのはあると思います。

mRNAかtotalRNAか、RNaseHの必要性 削除/引用
No.1609-1 - 2013/04/05 (金) 09:18:18 - こち
よろしく御願いします。

哺乳動物の組織からRNA iso plusで抽出したtotal RNAを材料に、RT-PCRでクローニング用のインサート(約1500bp)を得ようとしています。

手元にあったリアルタイムPCR用の東洋紡ReverTra Ace qPCR RT Master mix with gDNA removerで作成したcDNAを使って、PCRをしてみましたが、増幅産物を得る事ができませんでした(300bp程度のPCRのためには使えたのですが)。

そこでタカラバイオのPrimeScriptIIなどのクローニング用らしいcDNA合成キットを購入してやり直そうと考えています。このような目的の場合、oligotex dTなどでmRNAを精製してからcDNA合成すべきでしょうか?それともtotal RNAでもcDNA合成してよいでしょうか?

またcDNA合成後には、RNaseH処理が必要でしょうか?

それから、もし、ReverTra Ace qPCR RT Master mixを1500bpのPCR増幅産物をクローニングする目的のための前段としての、組織由来total RNAからのcDNA合成に使用するノウハウをご存知の方は、注意点を教えてください(例えば反応時間を15分から30分に延長する、遺伝子特異的プライマーを用いるな ど)。

よろしくお願いします。

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