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(無題) 削除/引用 No.1610-5 - 2013/04/06 (土) 10:26:22 - ~ 先生は指定した条件でPCRで増やせる根拠があるのかもしれません。 手間取るようであれば、とりあえず1回目のPCRで増えなかったことと、どう対応するつもりなのかを報告しておきましょう。 条件を言われるかもしれませんし、プライマーの配列を変えてもいいといわれるかもしれません。 少なくとも、言われたPCRをやらずに遊んでいるとは思われなくなります。 失敗とはどのような結果だったのでしょうか。 なにも増えない場合と、目的のバンドとほかのバンドの両方が増える場合と、ほかのバンドのみが増える場合では、対処法が変わってきます。 また、目的はクローニングでしょうか？定量でしょうか？ クローニングならば、非特異がでてもかまわないので目的のバンドらしきものが増幅するまで温度を下げて増やし、切り出して回収することができるかもしれません。 プライマーを作り直すのであれば今のプライマーよりも外に設計し、nested PCRにしてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1610-4 - 2013/04/05 (金) 21:58:01 - KEN 高い方の配列をけずり、低い方の配列を伸ばせば、Tm値が近くなるのでは？

(無題) 削除/引用 No.1610-3 - 2013/04/05 (金) 21:54:41 - まるやま 先生とフランクに話をするのが王道です。 という話は横においておいて、Tm値の計算方法は様々です。使用するPCRキットではどのようなTm値の計算方法をしているのかを調べた方が良いです。 そして先述の王道に戻る。

(無題) 削除/引用 No.1610-2 - 2013/04/05 (金) 10:24:47 - おお 20度ぐらい離れていてもできるものはできます。 ゲノムのPCRかRTPCRなのかとか詳しい情報がありませんが、ターゲットの配列が確実に使おうとしているサンプルの中にあるのかきになります。発現してないRNAを増やそうとしているとか、、、 ま、それをおいておいたとしてDMSOやベタインなどを使ってみるのもてだと思います。 あとはタッチダウン。 またTmの低い方だけでPCR反応を行い、その後高いほうも加えてPCRとかいうても取れなくはないですが、あいてが一本鎖であれば(RT産物とか)全く意味がない可能性もあります。 酵素も手に入るものは一通りやればいいかと。

プライマーのTm値が離れすぎている時の対処法 削除/引用 No.1610-1 - 2013/04/05 (金) 10:14:35 - zaiakukan こんにちは。 現在、植物を用いてPCRを行おうとしているのですが、 先生から指定されたプライマー2つのTm値が 53℃と72℃のように大きく離れています。 アニーリングを52℃に設定して 一度PCRをやってみましたが 失敗しました。 調べて見る限り、 Tm値の差はどんなに離れても 10℃以内に抑えるようにしなければならないようなのですが、 これらのプライマーを使ってPCRを行うことはできないのでしょうか？ もしやったことがある方がいらっしゃるなら 方法を教えてください。 よろしくお願いします。

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