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(無題) 削除/引用 No.1614-24 - 2013/04/08 (月) 09:53:42 - - ちなみに、ボスは論文投稿に関して、どう言っているのでしょうか？ リン酸化部位が同定できなければ絶対に論文を出さないというのであるなら、いくら違うジャーナルを勧めても問題解決にはならないでしょう。リン酸化部位同定についてさらに有用な情報をもらうための別トピックを立てた方が解決になると思います。 違うジャーナルを勧めて解決するようであれば、分子機構がなくても生理的意義で論文が通るようなジャーナルを皆さんに聞いた方が解決になると思います。

(無題) 削除/引用 No.1614-23 - 2013/04/07 (日) 18:55:49 - こまった部下 >[Re:19] おおさんは書きました : > ほかの雑誌でインパクトが高いところということも考えていいんじゃないでしょうか。 なるほど、そうですね。

(無題) 削除/引用 No.1614-22 - 2013/04/07 (日) 18:54:02 - こまった部下 >[Re:21] あさんは書きました : >、試した３５の他にあといくつあるのでしょうか。 ゼロです。 >[Re:20] qうぇrちゅいおpさんは書きました : >、、、エンリッチメントしてLC-MS/MSへgoでとりあえず普通にいけるんじゃね。、、、複数のプロテアーゼを組み合わせるとか、 既述、ほぼすべてやっています。 > 、、、あんまり口ださなくなるよ。 今回はなかなか引っ込まない。 > 競争の激しい分野とかだと、研究の完成度やhigh impact よりもspeed (プライオリティー確保）の方を優先するのが戦略的にみてbetterな場面も多々あるからね。 同意します。

(無題) 削除/引用 No.1614-21 - 2013/04/07 (日) 04:32:06 - あ 予想できるリン酸かサイトは、試した３５の他にあといくつあるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1614-20 - 2013/04/07 (日) 03:41:51 - qうぇrちゅいおp こういうのはあんまり良く分かんないけど、タグ付き人工蛋白質発現が無理っぽかったら、抗体作ってその超でかい蛋白質を精製して（トリプシンだけじゃあんまり小さくならないかもしれないから）２〜３種類くらいのプロテアーゼで取り敢えず小さい断片に切って適当な長さのペプチドにバラバラにして、最近出ている金属系のアフィニティー担体で精製してリン酸化ペプチドをエンリッチメントしてLC-MS/MSへgoでとりあえず普通にいけるんじゃね。たぶん成否の鍵はプロテアーゼ消化のとこかな。もとが大きいからたぶんペプチド断片があまり小さくならないかもしれない。それだと精製効率の低下とかマスの解析の能力が十分に発揮出来ないとかいった問題が起こるかもしれないから。複数のプロテアーゼを組み合わせるとか、事前に還元アルキルか＆変性処理とか、ゲル内消化でなくて、溶液中で処理するとか一工夫必要かもね。プロテオミクスの専門家とよく相談したほうがいい。 自分で実験しなくなったボスが、pubmed ＆学会情報をたよりに分かんない事言うのはとりあえずどこでもデフォ。いちいち気にしてたら上手く行くものもいかなくなるので、適当にハイハイ返事しながら自分で論文書いて、とりあえずこんな感じでいきますのでって原稿渡して、あなたの考えに沿って自主的に進めればどうよ。ボスとか偉い人って、あなたが、すくなくともそのテーマと周辺関係に関しては自分よりもよく分かっているみたいだと気がつくとその後はあんまり口ださなくなるよ。 競争の激しい分野とかだと、研究の完成度やhigh impact よりもspeed (プライオリティー確保）の方を優先するのが戦略的にみてbetterな場面も多々あるからね。単純に上を目指して時間をかけて一生懸命がんばるというのがいいことかどうかは分からない。機械主導の翻訳後修飾の網羅的解析が流行ってるし、似たようなことがどっかのサプリメンタルデータとかにポッて出てきたら、そもそも論文化すること事態がかなり危うくなるし。

(無題) 削除/引用 No.1614-19 - 2013/04/07 (日) 00:22:52 - おお Mol Cellならたしかにそういうデーターを追及するような雑誌なので、燐酸か部位を同定するとかした方が通りやすいでしょうね。生理的な現象などで重要であるなら、ほかの雑誌でインパクトが高いところということも考えていいんじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1614-18 - 2013/04/06 (土) 23:52:47 - こまった部下 中年さん、ありがとうございます。 あなた様の言われることは、かなりの部分がボスのいうことと合致します。

(無題) 削除/引用 No.1614-17 - 2013/04/06 (土) 22:34:18 - 中年 Mol Cellはまさにmolecularなことを要求される雑誌という印象ですので、最初のご質問に関しては、リン酸化部位の置換でその安定化が損なわれることを示さないと受理は難しいでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.1614-16 - 2013/04/06 (土) 22:31:42 - 中年 siRNAや阻害剤を使ってあるキナーゼを阻害することでそのリン酸化イベントが阻害されるからといって、そのキナーゼが直接そのリン酸化を触媒しているとは限りませんよね。おお様が既に指摘されているように、そのキナーゼにリン酸化されることで活性化される別のキナーゼが、問題の基質をリン酸化しているかもしれない。キナーゼによりけりではありますが、コンセンサスから外れたリン酸化部位を想定するよりも、そちらの方がありそうな気もしますが。

(無題) 削除/引用 No.1614-15 - 2013/04/06 (土) 18:58:26 - こまった部下 >[Re:14] qqさんは書きました : > いずれにせよ、リン酸化するというとき、リン酸化のストイキオメトリーが破綻していると、アーティファクトの可能性を除去できません。 リン酸化ペプチドの精製は先方にやってもらったのですがダメでした。in vivoリン酸化とIPをやっています。 >[Re:13] 小言幸兵衛さんは書きました : > トップジャーナル付近とはどこまでを指していますか？ Mol Cellくらいかもしれません。 > そのタンパク質の安定化にどのくらいの生理学的なインパクトがありますか？ かなりあります。

(無題) 削除/引用 No.1614-14 - 2013/04/06 (土) 18:44:00 - qq ＞これも、再度やろうとしていますが、MSのカバー率の関係であまり、 ＞期待できません。違う受託先を使う予定ですが、、、 リン酸化ペプチドを精製するのです。FeやTiで回収してもよいし、32pー標識で予めリン酸化ペプチドをHPLCで分離するのも手です。 いずれにせよ、リン酸化するというとき、リン酸化のストイキオメトリーが破綻していると、アーティファクトの可能性を除去できません。あとはあなたの英語力かな？

(無題) 削除/引用 No.1614-13 - 2013/04/06 (土) 18:36:30 - 小言幸兵衛 トップジャーナルとはどの雑誌を指していますか？ トップジャーナル付近とはどこまでを指していますか？ そのタンパク質の安定化にどのくらいの生理学的なインパクトがありますか？

(無題) 削除/引用 No.1614-12 - 2013/04/06 (土) 18:35:13 - こまった部下 みなさん、ありがとうございます。 >[Re:10] おおさんは書きました : > リン酸か部位をきめたー>トップジャーナルという公式はありません。 そうですか、、、、そうですよね。私もそう思います。 > 意地悪な反論を跳ね返すだけのエビデンスを得たことにもなります。 そこのバランスなんですが、当然、ミュータントがあったほうが良いということです。 >[Re:9] -さんは書きました : > そのリン酸化の生理的意義がどれほどインパクトがあるのか示せれば、リン酸化部位の同定有無は関係ないと思います。 私もそう思います。 > 生理的意義がそれほどインパクトがないのであれば、、、その方が投稿者様の今後のためになると考えている可能性もあるかもしれません。 生理的意義はおおありで、基本的には巨大であることは技術的な問題でしかありません。 > リン酸化部位を同定してもいいかもしれません。 やったのですが、MSのカバー率が高くないので、ダメでした。 別の委託先を考えています。 > in vivo実験からの情報を増やした方がいいように思います。 そのとおりの判断です。 >[Re:8] おおさんは書きました : ＞そこから実際に燐酸かされている部位をMASなどで見つけれないかとか思いますがどうなんでしょうか。 やったのですが、MSのカバー率が高くないので、ダメでした。別の委託先を考えています。 > 網羅的に燐酸かペプチドを同ていしているプロジェクトなどもあって、すでに発表されていますから、燐酸化される可能せいのある部分はしぼれるかもしれません。 確かにそうですね。留意します。 > あとはいろいろな生物種で保存されているとかそういうのも見ていくとあまり闇雲なアプローチは避けれる可能性はあるかもしれません。 保存の程度が高すぎて、無理でした。 > あとはvitroであまりあなたの仮説が反映されていないようですから、直接燐酸かしてない可能せいもかんがえて、もしそうなら最終的にどのように安定化しているのかという違う仮説も立てていった方がいいかもしれません。 可能性はきりがありません。阻害剤、siRNAからは仮説はただしいはずなのですが、、、 >[Re:7] TK-1さんは書きました : > リン酸かを促進するシグナル系は何か、その辺の情報がないと何とも言えない。 そうですが、情報提示に限界があります。

(無題) 削除/引用 No.1614-10 - 2013/04/06 (土) 12:57:21 - おお >トップジャーナル付近は難しいでしょうか？ すでに指摘がいろいろありますが、リン酸か部位をきめたー>トップジャーナルという公式はありません。どのくらいのインパクトのジャーナルに出せるかというのはあなたか、あなたの実験の結果を知っている人だけだと思います。 kdや阻害剤を使った実験では結局そのキナーゼが関与している(間接的かもしれない)ことしか示唆できません。意地悪なことをいうと阻害剤とかkdとかで仮説通りの結果でも、その人工的な系だけでそうなのであって、実際生理的には何にも意味がないかもしれないといえるかもしれません。リン酸か部位を決めたり、直接リン酸かしていることを示せると、生化学的にしっかりとしたデーターになりますのでその分インパクトに寄与するとはいえると思いまし、意地悪な反論を跳ね返すだけのエビデンスを得たことにもなります。

(無題) 削除/引用 No.1614-9 - 2013/04/06 (土) 12:15:51 - - 他の方もおっしゃっているように、そのタンパク質のリン酸化がこれまでの知見に比べてどれくらいインパクトがあるのか、また、そのリン酸化の生理的意義がどれほどインパクトがあるのか示せれば、リン酸化部位の同定有無は関係ないと思います。 ただ、リン酸化による安定化はあっても不思議ではないでしょうから、それが巨大タンパク質かどうかだけではインパクトは少ないように思います。生理的意義がそれほどインパクトがないのであれば、リン酸化部位を同定したところでインパクトが格段に上がるようには思えません。 ボスの方がどのくらいのジャーナルレベルなのか判断できており、リン酸化部位が同定できればある程度論文のレベルが上がるので、その方が投稿者様の今後のためになると考えている可能性もあるかもしれません。 おお様のおっしゃるように、まず、in vivoで直接リン酸化を受けているという確実な証拠があれば、リン酸化部位を同定してもいいかもしれません。 ＞＞in vitroで燐酸かの実験はやりましたが、、、in vivoの結果と合いません、、、困ったものです。 このような状況であれば、in vitroでいくら実験しても得られる結果はin vivoを反映していないようなので、in vivo実験からの情報を増やした方がいいように思います。

(無題) 削除/引用 No.1614-8 - 2013/04/06 (土) 11:25:56 - おお ひとつはそのキナーゼ潰したからといって、そのキナーゼが直接あなたの巨大タンパクを燐酸化しているとは限らないので、より直接的な根拠がないと、そういうclaimを出しにくいんだと思います。 安定化するならそこから実際に燐酸かされている部位をMASなどで見つけれないかとか思いますがどうなんでしょうか。 網羅的に燐酸かペプチドを同ていしているプロジェクトなどもあって、すでに発表されていますから、燐酸化される可能せいのある部分はしぼれるかもしれません。 あとはいろいろな生物種で保存されているとかそういうのも見ていくとあまり闇雲なアプローチは避けれる可能性はあるかもしれません。 そういうのを見直してから今度は燐酸かされる可能性のあるアミノ酸をDとかEに変えてみてもいいかもしれません。 あとはvitroであまりあなたの仮説が反映されていないようですから、直接燐酸かしてない可能せいもかんがえて、もしそうなら最終的にどのように安定化しているのかという違う仮説も立てていった方がいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1614-7 - 2013/04/06 (土) 10:57:14 - TK-1 蛋白が大きい リン酸化されることによって安定か それとトップジャーナルがどうつながるのか？例えば安定化が阻害されることに寄って何がおこるのか、それがどの程度重要なのか、リン酸かを促進するシグナル系は何か、その辺の情報がないと何とも言えない。

(無題) 削除/引用 No.1614-6 - 2013/04/06 (土) 09:53:03 - こまった部下 皆さんたいへんありがとうございます。とても参考になります。 >[Re:5] おおさんは書きました : > ターゲットのkinaseが分かってるんだったら、in vitroで燐酸かの実験ができますよね。巨大といってもまあ3つぐらいの部分に分けるとリコンビナント作れるんじゃないの。タイチンほどでかいとたいへんだけど。 それくらい大きいです。in vitroで燐酸かの実験はやりましたが、、、in vivoの結果と合いません、、、困ったものです。 >[Re:4] qqさんは書きました : > 先にリン酸化部位の候補を全て変異で潰すよりも、野生型をリン酸化してトリプシン消化・ペプチド同定の方が、（人によっては）まだ楽かもしれません。 > その後で、変異導入実験は必須です。 これも、再度やろうとしていますが、MSのカバー率の関係であまり、期待できません。違う受託先を使う予定ですが、、、 >[Re:3] まんさんは書きました : > まず35個くらい大変ではないですよね。そのような感覚の方にはトップジャーナルを目指す資格すら(以下略 そうですか、、、。楽しようとしすぎなんですか。全部つぶして、ネガティブなのでショックが大きいです。もちろん、普通でないところがPされる可能性もある（おそらく高い）のですが。STリッチなので。

(無題) 削除/引用 No.1614-5 - 2013/04/06 (土) 09:35:13 - おお ターゲットのkinaseが分かってるんだったら、in vitroで燐酸かの実験ができますよね。巨大といってもまあ3つぐらいの部分に分けるとリコンビナント作れるんじゃないの。タイチンほどでかいとたいへんだけど。

(無題) 削除/引用 No.1614-4 - 2013/04/06 (土) 09:28:10 - qq 先にリン酸化部位の候補を全て変異で潰すよりも、野生型をリン酸化してトリプシン消化・ペプチド同定の方が、（人によっては）まだ楽かもしれません。 その後で、変異導入実験は必須です。

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