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(無題) 削除/引用 No.1615-9 - 2013/04/08 (月) 23:48:47 - おお 5-6倍のレンジでは大丈夫みたいですね。んでも縦軸がコロニー数ではないですね。。。 経験上100倍位までいくと得られるコロニーはかなり減ります。それぐらい減るコンデションではポジの割合が高くなります。

(無題) 削除/引用 No.1615-8 - 2013/04/08 (月) 21:44:45 - 小言幸兵衛 古いMolecular Cloningから。 http://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/cloning/cloning_methods/restriction_enzymes/ligation.jpg 脚注にベクターのモル数は書いてありませんが、インサートのモル数が上がっても急激に効率が落ちる訳ではないようですね。1000倍はマズいと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.1615-7 - 2013/04/08 (月) 19:02:41 - AP 根本的な指摘をすると、そもそもligationのときにモル数でベクタよりインサートを過剰にすべし、というのはコンセンサスとはいえませんね。たいした根拠はないのでは？ Molecular Cloningなんかは、基本1:1くらいで、となっています。 Takaraの古いカタログ（今でもWebかなんかで公開しているかも）に、一定量のベクターに対してインサートの割合を0.1-10まで振ってligationした実験例が載っています。blue/white selectionをしてwhite colonyを数えると、10^5-10^7 cfu/ugくらいの幅になるんですが、一番低い10^5 cfu/ugでも（それよりさらに低くても）十分ですよね。 subcloningがうまくいかないと、ligationが悪い、ベクターインサート比が適当でないからだ、なんて当てずっぽうを言ったりする人もいますが、上記のようなことを考えると、あまりありそうにないことだと思います。比を振ってみたら、たまたま上手くとれた経験があったりして、それを信じこんでいるのかもしれませんが、そういうのってたまたまそうであっただけで、本当の原因は別のところにあるんだと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.1615-6 - 2013/04/08 (月) 14:58:30 - ~ ネットで1,000倍入れても大丈夫と言われた、と言い出さないように念を押したつもりでした。 >モル数的に多く入れることと先輩に言われたのですが、となると、たとえば、 ポイントになるのはここですかね。1,000倍は思いつきの数字ですよね。 先輩は、数倍から10倍程度を想定していったのではないでしょうか。 先輩が定量的な表現をしなかったことに問題があるかもしれませんが、 ライゲーション時のモル比は実験書やキットのカタログを見ればわかりますよね。

(無題) 削除/引用 No.1615-5 - 2013/04/08 (月) 10:22:48 - AP 両末端がリン酸化されている場合、インサート過剰だと、インサート同士のライゲーションによる重合の方が起こりやすくなり、重合したインサートをもつ不正なクローンが増えたり、ベクターに入りにくい重合体が出来たりして、形質転換効率や正しいインサートをもつクローンの割合が減ったりするでしょう。 合成オリゴやPCR産物をインサートとする場合、普通、末端はリン酸化されていないので重合は起こらず、脱リン酸化していないベクターに対してはセルフライゲーションを起こりにくくできるので、過剰量入れてもいい、というかそのほうが合理的です（1000倍過剰にはやり過ぎでしょうけれど、特に問題はないでしょう）。 まあ、ライブラリー作製など、なるべく多様なインサートをいっぺんに網羅的、効率的にベクターに入れなければならない場合はいざしらず、特定の断片をサブクローニングする場合なら、ベクター：インサート比率なんてあんまり考える必要はないです。比率を変えることで正しいライゲーション産物のできる効率は多少変わるかもしれませんが、ゼロにはなりません。この目的では正しいクローンが一個でも取れればいいはずですから。

(無題) 削除/引用 No.1615-4 - 2013/04/08 (月) 09:50:52 - おお >[Re:3] ~さんは書きました : > 確率的には取れるのではないかと。 > > 部下や後輩が根拠なくやろうとしたら止めますけど。 そうですね。単に無駄にインサート使っているだけのようなかんじですね。

(無題) 削除/引用 No.1615-3 - 2013/04/08 (月) 08:40:22 - ~ 確率的には取れるのではないかと。 部下や後輩が根拠なくやろうとしたら止めますけど。

(無題) 削除/引用 No.1615-2 - 2013/04/06 (土) 12:38:19 - おお このフォーラムで むかし、ベクターを制限酵素できって、ほすふぁたーぜ処理をせずに、合成したオリゴでつくった2本さ(末端がリン酸化されていない)を大過剰いれてライげーしょんするとちゃんとインサートが入ったのが取れると教えてくれた人がいます。 実際に何倍とはかってやったことはないので何ともいえませんが、非常に短いフラグメント(ベクターから切り出したもの)をベクターとバンドで見て同等程度の量をライげーしょんしてクローンを拾ったことがありますので、100倍まではいかないもののそれに近い量あったんだとおもいます。10個に一個ぐらいの割合でタンデムにつながったものがありました。 大過剰のインサートをいれると得られるコロニーの数が落ちてきますので1000倍入れるとどうなるかなぁと、、、特に長いインサートなら、取れなくなってもおかしくないような気がしますが、長いばあいはそんな量使うこと可能かどうかというのはありますけど、、、あ今はPCRで増やすことのほうが多いから可能かもしれませんね。

ベクターとインサートの比率 削除/引用 No.1615-1 - 2013/04/06 (土) 12:17:15 - よう お世話になっております。 ライゲーションでベクターとインサートを混合するとき、ベクターよりもインサートの方をモル数的に多く入れることと先輩に言われたのですが、となると、たとえば、ベクターよりもインサートのモル数を1000倍にして入れても、うまくライゲーションされるものなのですか？

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