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(無題) 削除/引用 No.1633-14 - 2013/04/16 (火) 08:37:10 - 組織 アセトン固定を短縮しては？ CD抗原の免疫染色なら、冷アセトン5分でも大丈夫と思います。 LCMを意識するなら、3分でもいけるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1633-13 - 2013/04/15 (月) 19:35:29 - omfs 〉組織さん 　JInさん 追加です。 結果としてはEt-OH＋酢酸で問題なくHE染色は出来るのですが、 残念ながらメインの免染は上手く行きませんでした。 アセトン固定でも組織の軽度収縮認めましたが、組織の形態は保たれていましたので 通常の免染ステップをふむと上手く行きました。 風乾だけでなく、固定方法でも大きく結果が異なるので、今回は非常に勉強になりました。 ただ、アセトン固定は時間がかかるので、 今は薄切→組織の状態をEt-OH固定でHE染色し確認（このステップだと固定から10分程度で出来ます） その後、実験に使えそうなサンプルの固定操作に入るようにしました。 時間短縮でかつきちんとサンプルの状態を確認できるので効率的かと思われます。 私の失敗が参考になれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1633-12 - 2013/04/15 (月) 17:28:48 - 組織 情報ありがとうございます。 凍結融解後の風乾は結構重要なので、それも効いているかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.1633-11 - 2013/04/15 (月) 16:41:02 - JIn よかったですね。 今回の件で風乾の大事さを私も改めて認識されました。 日本はこれから梅雨になり湿度、温度の管理が大変かもしれませんね。 切片がまた剥がれ始めたら、その辺も気にしてみてください。

(無題) 削除/引用 No.1633-10 - 2013/04/15 (月) 15:59:02 - omfs 〉組織さん トピックに記入した風乾60minというのは 切片きりながら、30minくらいして−２０℃に入れながら作業していたので実際60minではなかったようで きちんと常温で60minにすれば問題ありませんでした。 また、切り出したプレパの保存を-80度で行っていたので その時点から常温に取り出した際も15min風乾で処理すると問題ありませんでした。 処理後ですが、Et-OH+酢酸の方は処理後すぐにwashし、アセトンは風乾3min行いました。 アドバイスありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1633-9 - 2013/04/15 (月) 12:20:50 - 組織 うまくいってよかったですね。 ちなみに風乾は固定前と固定後のどちらのステップが問題だったのでしょうか？ また、風乾時間はどのくらい変更（延長）したのでしょうか？ 今後の参考に教えて下さい。

解決しました。 削除/引用 No.1633-8 - 2013/04/15 (月) 12:09:14 - omfs 皆様のアドバイスのおかげで解決しました。 �@４％　PFA �Aアセトン 30min �Bエタノール：酢酸＝19:1 30SEC/1min/2min/3min の方法を試してみました。 �Bに関しては今後、LCMで凍結切片を使用するので、その時のプロトコールにのっとってます。 結果としては、いずれもはがれませんでした。。。 というより、始めの実験で風乾が甘かっただけのようです。 ただ、PFAについては後の免染時に賦活化が必要な抗体があったりすることもあるようなので今回は使用しませんでした。 追加ですが、アセトンやPFAではやや組織の収縮があるように見えます。 �Bの方法ではパラフィン包埋と同じ組織像が見れるので、この方法を使用しようかと思います。 時間については２minが最も組織が綺麗でした。（私の感覚ですが） アドバイスありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1633-7 - 2013/04/12 (金) 21:11:52 - JIn 組織さんがおっしゃるように、 固定がしっかりされてればある特定の細胞が選択的になくなるなんてことは まずないと思いますけどね。 どんだけガシャガシャwashしたのかと。 クライオインジャリーという線は考えられませんかね。 他の組織の構造はしっかり保たれているのですか? 薄切直後に切片の状態を確認していますか?

(無題) 削除/引用 No.1633-6 - 2013/04/12 (金) 19:23:28 - omfs ありがとうございます。 〉染色中に特定の細胞がはがれるというのは奇異に感じるのですが、そもそも染色はうまくいってるのでしょうか？ 何も染まってないから無くなったように見えてる可能性はありませんか。 プロトコールに関しては、固定後の風乾をもう少し長く（30分）したらいいかなと思います。 色々調べて、 �@アセトン固定30min �A4%PFA固定 など試して最適な方法を調べてみようと思います。 今回、リンパ球がはがれていったのは、wash時の振盪が強かったで有ろうことと 風乾が甘かったのではないかと考えてます。 アドバイスありがとうございます。また上手くいかなかったら相談させてください。

(無題) 削除/引用 No.1633-5 - 2013/04/12 (金) 19:03:41 - 組織 染色中に特定の細胞がはがれるというのは奇異に感じるのですが、そもそも染色はうまくいってるのでしょうか？ 何も染まってないから無くなったように見えてる可能性はありませんか。 プロトコールに関しては、固定後の風乾をもう少し長く（30分）したらいいかなと思います。風乾が甘いとはがれやすくなります。

(無題) 削除/引用 No.1633-4 - 2013/04/12 (金) 18:56:14 - omfs 解答ありがとうございます。 〉固定法をいろいろ変えてみてはいかがでしょう 示されたHPを参考にして色々な方法を試してみようと思います。 冷アセトンにしたのは、私が参考にしていた本に、 固定はアセトン＞PFA＞メタノールとなっており、実際にPFAやメタノールで固定した際に組織の局在がみずらくなっており、 アセトンであれば組織破壊無く固定できると感じたからです。 〉染色中に切片の一部がはがれるというトラブルでしょうか。 スライドガラスは接着剤コート済みのものを使ってますか？ スライドガラスはMASコーティングされているものを使用しています。 染色過程中に一部の組織（特にリンパ球）がなくなるというトラブルで質問させていただきました。

(無題) 削除/引用 No.1633-3 - 2013/04/12 (金) 18:43:14 - 組織 染色中に切片の一部がはがれるというトラブルでしょうか。 スライドガラスは接着剤コート済みのものを使ってますか？

(無題) 削除/引用 No.1633-2 - 2013/04/12 (金) 18:37:11 - JIn 未固定標本−冷アセトン固定を用いる理由はなんでしょうか。 固定法をいろいろ変えてみてはいかがでしょう。 http://www.kbkb.jp/bus/fixed.html

ヒト凍結切片作成時のトラブル 削除/引用 No.1633-1 - 2013/04/12 (金) 16:56:27 - omfs 現在、凍結切片を利用した免染を行っています。 そこで、皆さんにお聞きしたいことがあります。下記流れで実験を行っているのですが、 切片中で確認したいリンパ球が流されて表現マーカーなどが見れずに困っています。 初歩的な質問となりますが、何かいい解決方法があったら教えてください。 ヒトサンプル（軟組織）を未固定標本でOCTコンパウンドに封入 ↓ Leica社クライオスタットで薄切 ↓ 風乾　60min ↓ 冷アセトン固定　10min ↓ 風乾　3min ↓ PBS wash 3min×３ ↓ ブロッキング　10min ↓ 一次抗体　　2hr RT ↓ PBS wash 3min×３ ↓ 二次抗体　　10min ↓ PBS　wash 3min×３ ↓ DAB染色 ↓ 脱水　（70-85-90-100%EtOH,xylen) よろしくお願いします。

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