Bio Technical フォーラム

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マススペクトメトリーについてお教え下さい トピック削除
No.1657-TOPIC - 2013/04/19 (金) 06:28:24 - いぶ
いつも大変お世話になっております。
細胞内にごく微量存在するなタンパクAとタンパクBの相互作用を見るために、マススペクトメトリーを考慮しています(タンパクA抗体で免疫沈降することはできるのですが、それをタンパクB抗体でウエスタンブロットしてもバンドが検出できないため、別の方法を模索している次第です)。今までやったことがないので、基本的なことを教えて頂きたいのですが、
@通常の細胞株を普通に培養してとったライセートをそのまま使用できるのでしょうか?それとも細胞に何か特別な準備が必要なのでしょうか?
A実際に機械にかけるまでに手順が必要なのでしょうか?
B色々な条件下での相互作用の増減を検討したいのですが、AとBの相互作用を定量することはできるのでしょうか?
C免疫沈降-ウェスタンで検出できなかった場合でも、もし本当に相互作用していれば、マススペクトメトリーで検出することはできるのでしょうか(検出感度は免疫沈降法より高いのでしょうか)?

もしご経験のある方がいらっしゃいましたら、ご教示を頂ければ幸いです。
よろしくお願いいたします。
 
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(無題) 削除/引用
No.1657-16 - 2013/05/03 (金) 11:00:53 - アメリカポスドク
完全に消すのは確かに難しいですよね。
ProteinA-HRPなども昔は使っていました。

(無題) 削除/引用
No.1657-15 - 2013/05/02 (木) 07:02:12 - いぶ
アメリカポスドク様

情報を頂き有難うございました。
実はTrue Blotは過去に試したことがあります。仰せのごとく、通常の2次抗体に比べればIgGバンドは小さくなるのですが、完全に変性できていないためか、どうしても完全にIgGバンドを除去することが不可能でした。IgGに対して目的バンドが強いシグナルであればそれでも問題ないのですが、Femtoなど強力な検出薬を用いた場合、IgGバンドも強調されてしまうため、IgGバンド付近に目的バンドがある場合、本当に検出できないのか、IgGに隠れているのかの判別がつきませんでした。プロトコール通りのサンプルバッファーを作成して、10分のボイルも行っております。タンパクを完全に変性させて、True BlotでIgGバンドを焼失させるコツなどがありましたら、是非ご教示を頂ければ大変ありがたいです。よろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用
No.1657-14 - 2013/05/02 (木) 03:59:03 - おお
>[Re:13] アメリカポスドクさんは書きました :

> True blotけっこういいですよ。
> http://www.cosmobio.co.jp/product/koutai_assei/cat414/cat416/rkl-20121225.asp?entry_id=10334

きれいですが、シグナルはよわいみたいですが。そのへんでなにか工夫されてますでしょうか、、、

(無題) 削除/引用
No.1657-13 - 2013/05/02 (木) 03:35:10 - アメリカポスドク
>IPとWBの抗体を逆にして試しましたが、重鎖と重なる位置で、Light Chain HRPなども使って重鎖の影響を少なくしていますが、バンド検出には至っていません。

True blotけっこういいですよ。
http://www.cosmobio.co.jp/product/koutai_assei/cat414/cat416/rkl-20121225.asp?entry_id=10334


(無題) 削除/引用
No.1657-12 - 2013/04/22 (月) 04:21:45 - いぶ
あqwせdrftgyふじこlp様

ご教示を頂き有難うございました。
両者の相互作用については、両タンパクを293T細胞で強制発現させれば、IPで強いシグナルを検出することができます。過去の論文で、内因性タンパクの相互作用を示したものが一つだけあるのですが、非特異バンドともとれるようなバンドで、信憑性に欠けている印象です。理論的にも、両者のタンパクは結合しうるドメイン(WWドメイン)とモチーフ(PPXYモチーフ)を有しており、強制発現モデルでこのドメインの変異型を作成すると結合できなくなります。私の場合、内因性の相互作用が、ある刺激により亢進するということを示したいので、細胞からとった抽出液で示す必要があります。IPとWBの抗体を逆にして試しましたが、重鎖と重なる位置で、Light Chain HRPなども使って重鎖の影響を少なくしていますが、バンド検出には至っていません。架橋剤というのは、使用経験がないのですが、もしご使用の経験がございましたら、具体的な使用方法や、どのような効果が期待できるのか、ご教示を頂けないでしょうか?お忙しいところを恐れ入りますが、よろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用
No.1657-11 - 2013/04/21 (日) 23:08:04 - あqwせdrftgyふじこlp
Pull-down assayでA-Bの相互作用がみられないということですが、そもそもA-Bが相互作用するという可能性はどのようにして導きだされたのかについて可能ならば教えてください。もしかしたらpull-downの結果が正しくて、ほんとうは相互作用していないという可能性はどうでしょうか。あと抗B抗体:IP/ 抗A抗体WBも試す価値あるとおもいます。

どうしてもというなら、最後の手段はtag-A and/or tag-Bを過剰発現させてtag-affinity精製してpull-downということになるとおもいます。でもデータが本来の姿を反映しているかどうかはわかりません。フォールスポジティブを拾うリスクも結構あります。ゆえに結果については慎重なバリデーションが必要になります。

架橋剤は場合によっては有効かとおもいますが、かならずしも成功するとは限らないみたいです。

(無題) 削除/引用
No.1657-10 - 2013/04/19 (金) 13:59:22 - いぶ
KY様

お返事いただき有難うございます。
プルダウンは行っておりませんが、過剰発現にて同じ抗体でIPを行い、WBで目的のタンパク質を検出できております。10pディッシュに500ulのバッファー(0.1%NP-40、50mM Tris 7.5、150mM NaCl、0.1% deoxycholate)で融解したものを1サンプル分としてすべて使用し、IP 2時間、protein Aビーズ2時間の組み合わせて行っております。ディッシュの大きさなど、これ以上の条件で行った事がないので、どこまで試行錯誤ができるか困っています。

(無題) 削除/引用
No.1657-9 - 2013/04/19 (金) 13:25:04 - KY
IPで結合が見れない物を、他で結合が見れたから結合しているというのはかなり厳しいことだと思います。IPがうまくいかない理由を発現が低いせいにしておりますが、過剰発現やプルダウンでは確認しているのでしょうか?IPと単にいっても、なかなかタンパク質により条件検討が大変な場合もあります。

他の方法をしいていえば、ツーハイでしょうが、それでもポジティブでも結局、IPで確認することが普通は求められます。

(無題) 削除/引用
No.1657-8 - 2013/04/19 (金) 10:16:29 - いぶ
おお様、感度が良すぎ様

ご教示頂きありがとうございます。よくわかりました。MSでは限界があるということですね。もう少しIPでの検討を続けてみようと存じます。

~様

大変参考になるご教示頂き有難うございます。
IP以外の方法について、もう少し情報を集めてみようと思っています。

(無題) 削除/引用
No.1657-7 - 2013/04/19 (金) 09:36:19 - おお
>[Re:3] いぶさんは書きました :
> おお様
>
> お返事いただき有難うございます。
> IP→WBでうまくいかなかったので、もしMSの感度が高いなら、IPフラクションを用いて、目的のタンパク質が検出できれば、相互作用ありとの結論が導き出せるのではないかと考えた次第です。

感度の指摘がありますが、そういうのをふくめて結論が導き出せるまでは行かないと思います。


> IP→WBもまだ試行錯誤中なのですが、それでもしどうしても検出が困難であった場合に、MSはタンパク同志の相互作用を検出する代替手段にはなりえないという事でしょうか?裏を取らなければMSではそのタンパク質と相互作用していると断定することは難しいとの解釈でよろしいでしょうか?

そう言う事です。もし過剰発現やその他の実験で相互作用とその生理的意義などがしめされていて、そういうバックグランドのなかで、MSでコントロールとの比較でクリアーな結果が出たうえで、その結合の生理的な意味に関係する現象がみれるという所まで引っ張れば弱いにしろ何とかなる可能性はあります。

(無題) 削除/引用
No.1657-6 - 2013/04/19 (金) 09:30:56 - ~
ttp://www.slideshare.net/haniabdelhamid/the-new-trends-of-maldi-ms-in-proteinprotein-interaction-12595301
MSでの解析は不可能ではないようですね。

表面プラズモン共鳴(SPR)のような2物質間の結合を見る装置も検討されてはいかがでしょうか。
ttp://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5538.pdf

どのような測定系を使うにしても、リコンビナントの両タンパク質を取っておくくらいの心づもりをしておいたほうがいいでしょう。

(無題) 削除/引用
No.1657-5 - 2013/04/19 (金) 09:22:25 - 感度が良すぎ
そのアイディアはたぶんダメです。
MSは感度が良すぎ、定量性にも欠けます。定量性にこだわるなら、特殊な方法がいります。

前の方の言うとおりです。

(無題) 削除/引用
No.1657-4 - 2013/04/19 (金) 09:21:37 - いぶ
おお様

すみません、もう一つ質問をさせてください。
もしIP→WB以外に、タンパクの相互作用を定量的に検出する方法がありましたら、ご教示を頂けないでしょうか?

(無題) 削除/引用
No.1657-3 - 2013/04/19 (金) 09:20:07 - いぶ
おお様

お返事いただき有難うございます。
IP→WBでうまくいかなかったので、もしMSの感度が高いなら、IPフラクションを用いて、目的のタンパク質が検出できれば、相互作用ありとの結論が導き出せるのではないかと考えた次第です。IP→WBもまだ試行錯誤中なのですが、それでもしどうしても検出が困難であった場合に、MSはタンパク同志の相互作用を検出する代替手段にはなりえないという事でしょうか?裏を取らなければMSではそのタンパク質と相互作用していると断定することは難しいとの解釈でよろしいでしょうか?
お忙しいところを大変お手数ですが、ご教示のほどよろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用
No.1657-2 - 2013/04/19 (金) 08:20:58 - おお
マススペクトメトリーは、得られた物質の質量を分析する機械です。いろいろと工夫することで、試料に存在するたんぱく質を断片化したペプチドの質量を求めたりさらにそのペプチドを断片化したりして配列や、どの遺伝子から発現しているかが同定できます。

この状態でどうやって相互作用を見るのですか?


IPフラクションをと言うならわかりますが、結局は裏を取る作業としてIP->WBなどしないといけないでしょうね。ぜったいにIP-WBでなければ裏が取れないかというとそうとまでいいきれませんけど。

マススペクトメトリーについてお教え下さい 削除/引用
No.1657-1 - 2013/04/19 (金) 06:28:24 - いぶ
いつも大変お世話になっております。
細胞内にごく微量存在するなタンパクAとタンパクBの相互作用を見るために、マススペクトメトリーを考慮しています(タンパクA抗体で免疫沈降することはできるのですが、それをタンパクB抗体でウエスタンブロットしてもバンドが検出できないため、別の方法を模索している次第です)。今までやったことがないので、基本的なことを教えて頂きたいのですが、
@通常の細胞株を普通に培養してとったライセートをそのまま使用できるのでしょうか?それとも細胞に何か特別な準備が必要なのでしょうか?
A実際に機械にかけるまでに手順が必要なのでしょうか?
B色々な条件下での相互作用の増減を検討したいのですが、AとBの相互作用を定量することはできるのでしょうか?
C免疫沈降-ウェスタンで検出できなかった場合でも、もし本当に相互作用していれば、マススペクトメトリーで検出することはできるのでしょうか(検出感度は免疫沈降法より高いのでしょうか)?

もしご経験のある方がいらっしゃいましたら、ご教示を頂ければ幸いです。
よろしくお願いいたします。

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