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(無題) 削除/引用 No.1662-11 - 2017/04/02 (日) 21:09:03 - q１２w３え４r５t 泳動中の拡散によるものだとおもいます。低分子量マ―カーは、もともとぼやけて見えやすいですが、泳動をあまりゆっくりにしすぎるとよけいなります。適切な泳動時間で行うとかゲル濃度を上げるとかすればあるていど改善します。

wQTVNaNWHJpvWzDbm 削除/引用 No.1662-10 - 2017/04/02 (日) 16:51:32 - Barnypok UOxwaZ http://www.LnAJ7K8QSpkiStk3sLL0hQP6MO2wQ8gO.com

(無題) 削除/引用 No.1662-9 - 2013/04/21 (日) 23:09:13 - あqwせdrftgyふじこlp ゆっくり流すとそうなることあります。

(無題) 削除/引用 No.1662-8 - 2013/04/21 (日) 22:14:40 - WB 皆さん有り難うございます。 研究初心者なのですが、現在オートファジーの研究を始めています。 14kD、17kDと近接した2つの蛋白（LC3-�U、LC3-�T）の発現をみるため16~18％のGELを使って10mAで泳動しています。 すみません、最初の質問の時に書いておくべきでした。 たしかに近接したサイズのタンパク質を分離してみるための条件で実験していたので、それにより低分子量のマーカーが単純に上下に拡散しているだけの可能性に気づいていませんでした。 Tris-tricin、グリセロールによる方法も試してみます。 有り難うございました。

(無題) 削除/引用 No.1662-7 - 2013/04/21 (日) 21:15:13 - qq >定電流　10mAで泳動 は、古典的に正しいのかも知れませんが、少なすぎない？ 1mm厚のミニゲル（断面積0.1x10cm^2）だとすると、20-30mAが最近の平均的な条件ではないでしょうか？泳動速度が遅くて、バンドの拡散が助長されることが万が一あるかも。

(無題) 削除/引用 No.1662-6 - 2013/04/21 (日) 03:27:42 - おお ちなみにグリセロールなら8%ぐらいから(たまたま80%のストックをつかって10倍しています。10%ぐらい入れるというのがたいていのプロとコールかとおもいます。5%でだめという根拠は手元にはありません)、うれあは少なくとも4Mぐらいというのが目安です。

(無題) 削除/引用 No.1662-5 - 2013/04/21 (日) 01:53:51 - おお 確かにバンドが少しスメアとまでいかないですが、シャープさにかけてきますね。低分子に有利にするにはグリセロールをいれる。尿素などもいいとはいわれます。Tris glycinの系をつかっているならセパレーション用ゲルのtris の濃度を600から750mMにあげる。750mMにするとてい分子領域はいいとおもいますがミドル以上はものによってはバンドが圧縮される代わりに横にひろがりはじめる。全部ではないようで比較的多い蛋白、たとえばアクチンとかは醜い状態になることがあります。断片化したペプチドではしばし750mMが使われるとこがあります。 Tris-tricinにするともしかしたらましかもしれませんが、グリセロールのためなのかもしれません。グラジエントにすると改善するような気がしますが、作るのはめんどうですよね。 あとマーカーのバリエーションを見ている可能性もあるので、目的のバンドがきれいかどうか全体の蛋白の染色でその領域にシャープなバンドがあるかなどみて、改善するか決めてみてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1662-4 - 2013/04/20 (土) 23:15:42 - KP 転写時間長すぎでは？

(無題) 削除/引用 No.1662-3 - 2013/04/20 (土) 21:20:32 - KY そもそも電気泳動とはタンパク質を距離的に分離するものですが、１６％のゲルだと、１０−２０kdaぐらいの領域のタンパク質が広く分離できますよね。ここで言う分離というのは二つのタンパク質間の距離だけでなく、一つのタンパク質間の距離でもあるわけです。そうするとそのあたりの一つのタンパク質ひとつ見た場合、そのタンパク質が一つのバンドでも上下によりモワっとバンドが広がることになるわけです。 だから、15kDaぐらいのタンパク質のバンドをピシッと見たいのであれば、逆に12%ぐらいにしてみたほうがいいと思います。もちろんその場合、他のタンパク質との分離度はいくぶん悪くなります。

(無題) 削除/引用 No.1662-2 - 2013/04/20 (土) 18:43:51 - qq 転写が前提ですか、それともCBBや銀染色でしょうか？ 転写が前提でないなら、マーカーをカラーマーカーからunstainedに変更してみることをお勧めします。 転写が前提であれば、allblue-markerか、やはりunstained-markerに変えることをお勧めします。unstainedの場合、転写後マーカーの部分だけ切り出し染色すればよろしいです。 色素の結合はタンパク質移動度に影響し、分子量の小さいタンパク質でその影響は大きくなると思います。 それとは別にサンプル中の共存する溶媒（塩とかdetergent・脂質など）の効果もあるかもしれません。

SDS-PAGEで分子量マーカーが低分子量で急に薄くなる 削除/引用 No.1662-1 - 2013/04/20 (土) 18:09:41 - WB お世話になります。 15kD前後のタンパク質の検出のためSDS-PAGEにて 泳動を行っています。 しかし、20kD未満の分子量マーカーのバンドが極端に薄くなってしまいます。泳動初期は低分子量のバンドも見えているのですが、泳動が進むにつれて20kD未満のバンドの色が急速に消退しているように見えます。20ｋD以上のバンドはくっきり見えていますが15kDのバンドはわずかに位置がわかる程度でバンド自体もぼやけています。 低分子量のタンパク質がGEL外に流れてしまうことなどあるのでしょうか？ GEL：16％のpolyacrylamide　gel（自作） 濃縮GELは1.5M　Tris　buffer　PH　8.8 分離GELは1.0M　Tris buffer PH 6.7 分子量マーカー：precision　plus protein dual Xtra standard 泳動バッファー：Tris-Glycine buffer+0.1％のSDS(自作） 定電流　10mAで泳動

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