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ネガティブ染色(電顕)について トピック削除
No.1667-TOPIC - 2013/04/22 (月) 19:55:49 - ＮＴＳ
電子顕微鏡初心者です。

　とあるウイルス粒子(正確には、人為的に作製したウイルス様粒子)を
ＴＥＭを使って観察したいと考えていますが、うまくいかず困っています。
染色法はネガティブ染色を使っています。

　症状としては、真っ黒なオブジェクト(ゴミ？)がほぼすべてのグリッドを覆ってしまっており、観察がまともにできません。サンプルを10倍、100倍希釈しても同様の症状が見られますので、おそらくは染色時の手技が問題と思われます。

　染色液は濾過した3%リン酸タングステン水溶液を使っています。
また、メッシュはコロジオン膜貼り付きメッシュ(400メッシュ)を使っています。

　手技の手順は以下の通りです。作業の全ては安全キャビネット内で行っております。

@メッシュ上にサンプル液を滴下する。10分静置。
Aろ紙でサンプル液を吸い取る。
B3%リン酸タングステン水溶液でメッシュ表面を洗う。
C予めパラフィルム上に滴下した3%リン酸タングステン水溶液に、メッシュ表面を1秒ほど漬ける。これを計2回行う。
D自然乾燥
E観察までデシケーター内で保存

　サンプルについてですが、塩化セシウム溶液を用いた超遠心で白いバンドが見られ、なおかつそのバンドを含むフラグメントをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけると、ウイルス粒子蛋白と同じ分子数付近にバンドが見られます。そのため、ウイルス粒子がサンプルに含まれているのはまず間違いないと思われます。なお、電顕のサンプルは白いバンド部分を×1として、×10または×100に無血清培地で希釈して使用しています。

　問題の切り分けのため、
Ａ．染色したサンプル
Ｂ. 無染色のサンプル
Ｃ．サンプル希釈液のみ
Ｄ．染色液のみ

　の４つを電顕で見てみようと思っていますが、これ以外にも何か打つ手等ありましたら、お教えいただければ幸いです。

　お時間を割いていただき、ありがとうございました。

　
　
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(無題) 削除/引用
No.1667-5 - 2013/04/26 (金) 14:26:02 - qq
重合したチュブリンですから、MES/KCl/GTP/MgCl2（普通のtubulin重合液）だったと思います。なんせ、むーかしのことですから、あいにく覚えていません。

ありがとうございました。 削除/引用
No.1667-4 - 2013/04/25 (木) 21:51:51 - ＮＴＳ
＞qq様

　返信が遅れ、申し訳ありません。
実は、お教えいただいたHPを見て染色プロトコールを作りました。

　qqさんが行ったネガティブ染色では、サンプルの希釈液は何を使用しましたか?
お教えいただければ幸いです。

＞ネガ様

　お教えいただき、ありがとうございます。
染色液のpHで粘性が変化するのですね。そこまでは考えが至りませんでした。
検討させて頂きます。

(無題) 削除/引用
No.1667-3 - 2013/04/25 (木) 20:41:52 - ネガ
同じくリンタングステン酸のネガティブ染色で、タンパク質分子をTEM観察する機会がある者です。

”真っ黒なオブジェクト”は電子線が透過しないほど分厚く乾いたリンタングステン酸ではないでしょうか。
染色剤のpH調整にKOHかNaOHを使用すると思いますが、アルカリが加わるほど粘性が上がり、グリッド上の凹凸に染色剤が溜まりやすくなります。
染色剤濃度を3%未満、pHを酸性寄りに何点か染色条件を検討されてみてはいかがでしょうか。
試料同様に、染色剤も濾紙で吸い取るほうが良いと思います。

私が観るのは分子なので参考にならないかもしれませんが、
1% リンタングステン酸水溶液（pH 4.0）でネガ染しています。
非常に薄いコントラストになります。

(無題) 削除/引用
No.1667-2 - 2013/04/23 (火) 12:18:11 - qq
hitachiのHPなんか役に立ちそうです。
www.hitachi-hitec.com/science/technique/chapter8_1.html
むーかし、チュブリンを酢酸ウランでnegative染色して、チューブ構造を観察しました。

ネガティブ染色(電顕)について 削除/引用
No.1667-1 - 2013/04/22 (月) 19:55:49 - ＮＴＳ
電子顕微鏡初心者です。

　とあるウイルス粒子(正確には、人為的に作製したウイルス様粒子)を
ＴＥＭを使って観察したいと考えていますが、うまくいかず困っています。
染色法はネガティブ染色を使っています。

　症状としては、真っ黒なオブジェクト(ゴミ？)がほぼすべてのグリッドを覆ってしまっており、観察がまともにできません。サンプルを10倍、100倍希釈しても同様の症状が見られますので、おそらくは染色時の手技が問題と思われます。

　染色液は濾過した3%リン酸タングステン水溶液を使っています。
また、メッシュはコロジオン膜貼り付きメッシュ(400メッシュ)を使っています。

　手技の手順は以下の通りです。作業の全ては安全キャビネット内で行っております。

@メッシュ上にサンプル液を滴下する。10分静置。
Aろ紙でサンプル液を吸い取る。
B3%リン酸タングステン水溶液でメッシュ表面を洗う。
C予めパラフィルム上に滴下した3%リン酸タングステン水溶液に、メッシュ表面を1秒ほど漬ける。これを計2回行う。
D自然乾燥
E観察までデシケーター内で保存

　サンプルについてですが、塩化セシウム溶液を用いた超遠心で白いバンドが見られ、なおかつそのバンドを含むフラグメントをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけると、ウイルス粒子蛋白と同じ分子数付近にバンドが見られます。そのため、ウイルス粒子がサンプルに含まれているのはまず間違いないと思われます。なお、電顕のサンプルは白いバンド部分を×1として、×10または×100に無血清培地で希釈して使用しています。

　問題の切り分けのため、
Ａ．染色したサンプル
Ｂ. 無染色のサンプル
Ｃ．サンプル希釈液のみ
Ｄ．染色液のみ

　の４つを電顕で見てみようと思っていますが、これ以外にも何か打つ手等ありましたら、お教えいただければ幸いです。

　お時間を割いていただき、ありがとうございました。

　
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