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(無題) 削除/引用 No.1674-5 - 2013/04/24 (水) 14:19:18 - おお 突出リンカーをNじゃなくI(イノシン)にしたらこうりつよくなるかな。。。ライゲーズが効くかちょっと調べてみないとわからないですけど、、、

Re: 削除/引用 No.1674-4 - 2013/04/24 (水) 13:02:19 - UC おおさん、ご回答ありがとうございます。 >その切り出された配列は均一なはいれつですよね、、、 均一の意図するところが分かりかねますが、制限酵素の認識部位はユニークです が、その周辺〜両端は何でもありで、50bp程度に切り出す特殊な制限酵素です。なので、Sangerで見てみると、周辺部位は塩基が入り乱れて全く読めない可能性 があります。その時は、次世代シークエンサーで1アンプリコン毎に読めばよいと 思っているので、とにかくベクターに組み込めればと思っている訳です。 でも考えてみたら、おおさんのご回答のように出来るということは、次世代シー クエンサー用のアダプターでligation出来れば、そのまま次の工程に進めます ねぇ。

(無題) 削除/引用 No.1674-3 - 2013/04/24 (水) 12:24:26 - おお NNNN突出した T7プロモーターはいれつをももつリンカーをつくり、得られたフラグメントの数分の1の量をライゲーションして(なるべく両端にT7が来ないようにモル比で可也少な目にくわえる)、その後NNNN突出したSP6リンカーでライゲーション。T7、SP6でPCRすればどうかな、、、

(無題) 削除/引用 No.1674-2 - 2013/04/24 (水) 12:07:27 - おお 何とかコンカテマーをつくってPCRしたいところですね、、、ちょっとかんがえてみます。 それか、切り取る前の配列からはあぷろーちできないのかな、、、その切り出された配列は均一なはいれつですよね、、、

50bpのDNA断片をベクターに組み込みたい 削除/引用 No.1674-1 - 2013/04/24 (水) 09:16:27 - UC いつも勉強させてもらっています。 タイトルの件ですが、ある制限酵素で処理すると、酵素認識部位を 中心に両端は4bpのsticky-endでDNA断片を切り出します。長さは 50bpぐらいです。この切り出された断片をSangerシークエンスしたいのですが この両端の塩基配列は、ランダム（実は中心の認識配列以外はランダム）です。 5'-NNNNNNNNNN....NNNN -3' 3' NNNNNN....NNNNNNNN -5' 100bp以上あるならば、何とかSangerで、とは思いますが短い断片です。 末端の塩基が既知ならば、定石通り、ベクターも対応する配列で切り出して 組み込んでシークエンスすれば良いと思いますが、この場合は、何かうまい 方法がありますか？ 思いついたのは、末端4塩基はKlenowか、T4 DNA polymeraseで平滑化して ベクター側もblunt-endにしてligationという流れですが、これでうまくいくか どうか分かりません。因みに、大腸菌を扱える施設ではないため、クローニング などは出来ないので、ベクター(手持ちにpGL3Basicあり)に組み込ませた後は ベクター側のプライマーでPCRしてゲルで切り出して、シークエンスしてみよう と思っています。 何かアドバイスなどいただけたらと思います。

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