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(無題) 削除/引用 No.1685-11 - 2013/05/02 (木) 03:27:34 - アメリカポスドク 少し話がずれますが、自分の経験ではLA-Taqが最も増幅効率が良いように思います。

(無題) 削除/引用 No.1685-10 - 2013/04/28 (日) 17:39:28 - Pumpkin 独り言様 この生物は、モデル生物でないので自力でとるしかない状況です。 おお様 100bp程度の定量PCRは増えるので、これのシークエンスをするのが先ですね。やっぱり。 RT様 cDNA合成は、randam hexmer と oligo dtのミックスです。 これを鋳型に前述のプライマーで定量PCRをかけています。 ---------------------------------------------------- F1→←R1　　　　F2→←R2　　　　F3→←R3 という感じです。 それぞれのプライマーセットは、アンプリコンがすこしづつ 違うのですが、これは電気泳動的に長さがあっていることは 確認しています。 しかし、F1-R2や-R3にすると増えないんですよね。 R1,R2,R3でRTしたものを鋳型にしてみます。 RACEが伸びなかったので、だめそうな感じはするのですが。 ともかくアンプリコンのシークエンスが先決でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1685-9 - 2013/04/28 (日) 16:58:55 - RT RTプライマーは何をお使いになっていますか？ 例えばR2をRTプライマーにして、F1R1のようにワークしているPCRを動かして増えますか？ RTの配列特異性はあまり高くありませんので増えたからつながっているとは限りませんが、逆に言えば、これで増えないとExonが繋がって転写されてない可能性もありますかね？Alternative splicingとかプロモータの位置が違うとか？

(無題) 削除/引用 No.1685-8 - 2013/04/27 (土) 05:33:18 - おお 発現していない可能性はあるとおもいます。PCRは増えないといずれにしろ結論づけにくいとおもいます。 それも発現していないというのはいろんなとらえ方があって、その予測が間違っている。ゲノムの配列があやしい。調べている組織ではその予測のmRNAはないなどもかんがえられます。単純なRTPCRだとその遺伝子からみて-鎖からのRNA産物もひっかかります。 ノーザンとかでいろいろな位置のプローブでシグナルのサイズと有無からというてもあるかもしれませんけど、それよりもゲノムを取ってきた方がいいような気がします。あるいはRACEをつかってPCRがかかる所からのばしていくか。

(無題) 削除/引用 No.1685-7 - 2013/04/27 (土) 01:35:31 - 独り言 全長のcDNAクローンが売ってたり、ESTがあったりすれば、発現している可能性は高いかもなぁ。 http://www.thermoscientificbio.com/molecular-biology/gene-expression-cdna-orf そもそもメジャーな生物じゃないのかなぁ。

(無題) 削除/引用 No.1685-6 - 2013/04/26 (金) 19:39:31 - Pumpkin 情報が小出しになってしまって申し訳ないのですが、 定量PCRの前にマイクロアレイをやっていて、 その結果を定量PCRでバリデーションで、相関あり。 でRACEしたら伸びないんで、少し長めの断片から取ろうとして、 これまた伸びないという経緯です。

(無題) 削除/引用 No.1685-5 - 2013/04/26 (金) 19:22:50 - Pumpkin -RTで増幅がないことは確認しています。 それとF1-R1, F2-R2, F3-R3がぞれぞれ異なる断片長で、 長さがそれぞれと一致することは確かめています。

(無題) 削除/引用 No.1685-4 - 2013/04/26 (金) 19:20:57 - Pumpkin なぜ未確認様、 仰るとおりです。まずはシークエンスですね。 あとはゲノムを増やしてみようと思います。 案外とゲノムデータが間違っているということも、 あるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1685-3 - 2013/04/26 (金) 19:19:56 - なぜ未確認 また、もしプライマー　F1とR1、F2とR2、F3とR3　が、それぞれ同じExon内に設計されているのならば、 最初の実験のPCR産物が、ゲノムDNAの混入による増幅産物であって、 実はmRNAの発現が無いという可能性も考えられます。

(無題) 削除/引用 No.1685-2 - 2013/04/26 (金) 19:10:09 - なぜ未確認 まあ、まずは最初の３つのPCR産物:F1-R1, F2-R2, F3-R3が 目的のものかシークエンスして確かめる事からはじめます。

PCRで長断片が増えない 削除/引用 No.1685-1 - 2013/04/26 (金) 17:47:53 - Pumpkin いつもお世話になります。 皆様のお力を借りたいのですが、 ゲノムが分かっている生物種の予測遺伝子A2.5Kbについて、 発現をみるために5'側　F1-R1、中央 F2-R2、3'側 F3-R3と100bpほどの 増幅産物になるように、定量PCR用プライマーセットを作製し、 これらがワークし、発現していると考えました。 （断片長は合っていますが、これをシークエンスはしていません）。 遺伝子Aは予測遺伝子であって、クローニングされていないので、 クローニングを目的にまずは断片を得るためにF1-R2, F1-R3, F2-R3 でPCRをかけましたが、これらが全く増えません。 最大断片長は1.5kbなので、それに対応するようにPCRを組んでいます。 なんとかクローニングする方法を考えたいと思いますが、 そもそもこのような場合、遺伝子Aが実は発現していない という場合がありえるかと思いますが、 皆様はどのようにお考えになりますか？

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