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アガロースゲルでの18bpの差の検出法
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No.1691-TOPIC - 2013/04/30 (火) 18:01:19 -
憲
300〜400bpのPCR産物の、18bpの差をアガロースゲル電気泳動で確認できないでしょうか?
過去のトピックを参考にして4%のアガロースゲルで試してみたのですが、バンドは出せるものの、差をはっきりと確認できませんでした。
EtBrはゲルにのみ加えています。
詳しい方がいたら、ゲルの濃度や方法についてアドバイスをいただきたいです。
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No.1691-11 - 2013/05/03 (金) 13:51:11 - アメリカポスドク
独り言さんがおっしゃっているように、いくつかの断片に制限酵素で切ってから流す事でみえるのではないでしょうか。
(無題)
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No.1691-10 - 2013/05/01 (水) 01:20:06 - 独り言
PCR産物を1,2カ所切断できる制限酵素サイトがあるといいんだなぁ
(無題)
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No.1691-9 - 2013/05/01 (水) 00:53:18 - おお
>[Re:5] qqさんは書きました :
> polyacrylamideが最善だと思うけど、
私もそう思うんですが、、、 Mupid にもPAGEように空気の接触を防ぐふたがツイてて作れるようになって他と思いますけど。。。いまはそうじゃないのかなぁ、、、
どちらか一方だけが切れる制限酵素をつかうと長さが大きく変わるのでみやすいとおもいます。
(無題)
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No.1691-8 - 2013/04/30 (火) 21:58:00 -
qq
UVで見ることが重要なのか分かりませんが、18bpを含む(含まない)オリゴを使ってsouthern blotも有りなのではないかと思います。
(無題)
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No.1691-7 - 2013/04/30 (火) 21:31:06 - AP
確かに、300〜400bpの分離を最大にするには4%は硬すぎますね。
FMC (NuSieveやSeaKemを販売している会社)の資料に、同社の製品でアガロース濃度、バッファーごとの泳動像があったと想います。見たい範囲の分離を良くするのにどうしたらいいか参考になるでしょう。
(無題)
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No.1691-6 - 2013/04/30 (火) 20:08:20 - モモ
大きなゲルを使ってEtBrを後染めにすれば十分見れる差じゃないですかね?ゲルは1.8%アガロースーTBEぐらいで十分では。
(無題)
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No.1691-5 - 2013/04/30 (火) 19:41:56 -
qq
polyacrylamideが最善だと思うけど、そのような技術はないと言うことなのですね。
残念なことです。仕方ありません。
(無題)
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No.1691-4 - 2013/04/30 (火) 18:58:20 -
憲
早速のアドバイスありがとうございます。
アガロースはElectranのAgaroseを使用しています。
バッファーはTBEです。
ポリアクリルアミドゲルはラボになくて…
invitrogenのUltraPure Agaroseなら同僚が持っていますが。
(無題)
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No.1691-3 - 2013/04/30 (火) 18:34:58 - Pumpkin
アガロースゲルについてはAPさんの指摘どおりですが、
ポリアクリルアミドゲルではだめ?
(無題)
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No.1691-2 - 2013/04/30 (火) 18:15:43 - AP
もうちょっと短いと確実に区別できるんだけれど、
side-by-sideで流して比較すれば区別できない範囲ではないと思う。
ゲルの品質、仕様やバッファー系なんかの影響が大きいと思うのですが、そのへんはどうしていますか?
4%だと低融点(低粘度)で品質のよいアガロースを使う必要があるし、
バッファーはTAEよりTBEが分離が良いだろうし、
ゲルにEtBrいれて泳動するのは、微妙なサイズを分離するには避けるべきだし、短い断片はEtBrが逆方向に泳動されて染色が薄くなって見づらいだろう。
アガロースゲルでの18bpの差の検出法
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No.1691-1 - 2013/04/30 (火) 18:01:19 -
憲
300〜400bpのPCR産物の、18bpの差をアガロースゲル電気泳動で確認できないでしょうか?
過去のトピックを参考にして4%のアガロースゲルで試してみたのですが、バンドは出せるものの、差をはっきりと確認できませんでした。
EtBrはゲルにのみ加えています。
詳しい方がいたら、ゲルの濃度や方法についてアドバイスをいただきたいです。
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