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Western blottingにおけるローディングコントロールについて トピック削除
No.1697-TOPIC - 2013/05/01 (水) 14:20:27 - Veil
初めて質問させていただきます。

現在、Autophagy関連タンパクに注目して実験を行っているのですが、mTORなど高分子量のタンパクを検出する際、Actinなどのローディングコントロールが流れきってしまうため、補正を掛ける事ができません。

どなたか比較的大きな分子量のコントロールをご存じでしたら教えていただけませんでしょうか。

よろしくお願いします。
 
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No.1697-10 - 2013/05/02 (木) 22:52:45 - あqwせdrftgyふじこlp
PVDF膜ならシグナルの検出まで一通り終わった後、膜を水かあるいはPBSで何回かすすいでから、CBBで染色、(メタノール酢酸で脱色、抜けが結構早いので脱色しすぎに注意。もちろん染色のやり直しは可能。)出来ます。とても簡単ですし、乾くと見た目きれいです。感度的にも十分OKです。アプライ量にばらつきとかあると結構明瞭にわかります。
特定の蛋白質をローディングコントロールにつかうことに疑問があって、ここ数年は、私も総蛋白をスキャンして補正しています。論文とかでも特に批判されたことはないです。

(無題) 削除/引用
No.1697-9 - 2013/05/02 (木) 21:27:27 - Edo
おお様

文献まで提示していただきありがとうございました。確かにローディングが安定していないと総蛋白でもばらつきますよね。
ポンソーとかはすごく簡単なので何か楽をしているような気がしてしまっていました。

(無題) 削除/引用
No.1697-8 - 2013/05/02 (木) 14:54:19 - おお
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2567873/
第一選択かどうかは個々の研究者の判断になるかとおもいますし、実験にもよるかとおもいます。たとえば貴重なサンプルとかで1ugぐらいしかのせれなかったら、ポンソーではきびしいでしょう。
インターナルコントロールも定量のためなのか、ほぼ比較ができる量のっているよということを示すためのものなのか、ライセーとのクオリティーをしめしたいのか、、、いろいろありますよね。

(無題) 削除/引用
No.1697-7 - 2013/05/02 (木) 14:41:59 - おお
総蛋白のほうが安定しているという論文がありました。ローディングが安定してなかったら総蛋白で見てもばらついていると思います。

(無題) 削除/引用
No.1697-6 - 2013/05/02 (木) 14:18:32 - Edo
ローディングコントロールのトピックなので便乗で質問をさせていただきたくて投稿しました。おおさんがおっしゃるように最近ポンソーなどの膜に転写した総タンパクの染色を見ることが多くなっています。人によっては病態でactinなどは変化するのでloading controlとしては使えない、ポンソーなどを使うべきだという人がいます。確かに変化することもあるとは思うのですが、そう言う人達はサンプルのローディングに問題があることもあるのではないかとも思うのですが。aそれともやはりポンソーなどを第一選択に考えるべきなのでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.1697-5 - 2013/05/01 (水) 23:24:54 - おお
違うげルでもいいかと思います。膜に転写した総蛋白の染色でもいいかと。

(無題) 削除/引用
No.1697-4 - 2013/05/01 (水) 19:00:55 - ~
解決なので余談になるかもですが、別のゲルで同じサンプル量(もしくは比率)で流したものをactinをウエスタンするんじゃだめなのでしょうか?
やりたいことはわかりますが、そこまでみなさん厳密に同じゲルでってやってますかね?

(無題) 解決済み 削除/引用
No.1697-3 - 2013/05/01 (水) 14:56:04 - Veil
>おおさん

早速の回答ありがとうございます。

教えて頂いたものが使えそうですので、やってみたいと思います。

また何かありましたら質問させていただきますが、今回はこれで解決済みとさせていただきます。

ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.1697-2 - 2013/05/01 (水) 14:51:35 - おお
http://www.labome.com/method/Loading-Controls-for-Western-Blots.html
laminとかHSC70でしょうか。。。
vinculinとかもサイズ的にはいいかもしれません。vinculinあまりみないですけど。。。

Western blottingにおけるローディングコントロールについて 削除/引用
No.1697-1 - 2013/05/01 (水) 14:20:27 - Veil
初めて質問させていただきます。

現在、Autophagy関連タンパクに注目して実験を行っているのですが、mTORなど高分子量のタンパクを検出する際、Actinなどのローディングコントロールが流れきってしまうため、補正を掛ける事ができません。

どなたか比較的大きな分子量のコントロールをご存じでしたら教えていただけませんでしょうか。

よろしくお願いします。

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