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(無題) 削除/引用 No.17-16 - 2012/01/19 (木) 00:22:24 - ABZO 話聞く限りでは系統的な問題だな。まずはブロッティング装置が一番怪しいな。すごいそう思う。ウェットならスポンジがつぶれてきたとか、カセットホルダーが褶曲気味になったとかで、密着不良。それか泳動槽内部で変な風に断線して均一な電場にならないとか。装置を一度メーカーに点検してもらうといい。それかパワーサプライが変な感じに不安定になっているかもしれない。 セミドライだと昔の炭素板電極だと経年劣化で板が変形してくる（変な風に褶曲してくる）と、よくそんな感じの問題がおこったな。 最近のステンレスのセミドライでも、やっぱ電極の異常があって板全体に均一な電場がかからなくなることは十分ありえる。これもとりあえずメーカーに点検依頼だな。 いずれにしても、電気物は素人が下手にいじると大変危険だから、変にいじくり回さずにメーカにお願いする事が大切だな。

(無題) 削除/引用 No.17-15 - 2012/01/11 (水) 22:42:53 - う 本日検出しましたが、真っ白でバンドが全く出ませんでした。 transfer後のゲル染色では高分子量の所以外は染まらず、クリアだったので転写ムラの可能性はなさそうです。 サンプルの問題かもしれません。 別のサンプルでしてみます

(無題) 削除/引用 No.17-14 - 2012/01/10 (火) 20:35:29 - う もくもくさん、ありがとうございます。 フィルム感光の可能性はないです。 あと現像器は施設共用備品で比較的管理がしっかりしているので、現像液などの可能性も低いかと思います。今度、現像しておかしな場合には別の現像器でも確認しようと思います。

(無題) 削除/引用 No.17-13 - 2012/01/10 (火) 14:23:30 - もくもくさん No.17-5を見て思ったのですが、現像液の元ストックが古かったりしませんか？変なムラやシミは古いものを使ったときによく出ました。 あとはフィルムを開ける/切るときにチョロッと感光させたりしてませんか？

(無題) 削除/引用 No.17-12 - 2012/01/09 (月) 12:25:54 - う monさん、ありがとうございます。 ブロッティング装置はいくつかあるので、変えて行ってみます。 他メーカーのセミドライでもやってみるつもりです。 また報告します。

(無題) 削除/引用 No.17-11 - 2012/01/09 (月) 12:00:59 - mon となると、ブロッティング装置の不具合ですかね？ 電極板の部分的・スポット的な腐食による不均一な導電や、 押さえつけ（バネ）の力不足による不均一な導電でしょうか。 他の装置が有れば、あるいは借りて試してみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.17-10 - 2012/01/09 (月) 11:24:23 - う ＞局部的な問題かもしれないので、Prestainがきれいに転写されていても目的のサンプルがうまく転写されていない（もしくはえいどうされていない）可能性もあります。その転写後のゲルをクマシーで染色してみましょう。移り残りは結構あるので、問題のバンド付近のバンド像で判断がつくでしょう。 アドバイスありがとうございます。メンブレン染色だけ転写後のゲル染色も試してみます。 ＞あとはシグナルが強く出るアクチンとかの抗体（シグマのモノクローナルがよかったが、ウサギ抗体でもんだいならウサギ抗体でのポジコンを取る）であとで（もしくは独立に<ベター）染めてみます。これでどこが悪いか判断がつくでしょう。 マウス抗体ではひどくないことが多いです。ただ別のウサギ抗体も試したのですが改善ありませんでした。今まで使っているメーカーと同じウサギ抗体を買い直してみます。

(無題) 削除/引用 No.17-9 - 2012/01/09 (月) 11:08:41 - う ＞二次抗体がかなりヘタっている可能性はないでしょうか？ 確かにinternal controlやかなり強くでる抗体では問題ないことがあるので ２次抗体のへたりも考えて別の２次抗体も使いましたが駄目でした。 ＞アトーのＨＰにある資料に該当する症状はありませんか？ これでいえばP2図５左のバンドのムラの感じに近いものが、１レーンではなくほぼ全てのレーンにでてしまいます。バックについてもも図４のようなもやもやした物ではなく、バッドの孔のようなかなりはっきりしたものがでます。

(無題) 削除/引用 No.17-8 - 2012/01/09 (月) 11:04:03 - クマシーで染色 局部的な問題かもしれないので、Prestainがきれいに転写されていても目的のサンプルがうまく転写されていない（もしくはえいどうされていない）可能性もあります。 その転写後のゲルをクマシーで染色してみましょう。移り残りは結構あるので、問題のバンド付近のバンド像で判断がつくでしょう。 あとはシグナルが強く出るアクチンとかの抗体（シグマのモノクローナルがよかったが、ウサギ抗体でもんだいならウサギ抗体でのポジコンを取る）であとで（もしくは独立に<ベター）染めてみます。これでどこが悪いか判断がつくでしょう。

(無題) 削除/引用 No.17-7 - 2012/01/09 (月) 10:54:17 - mon アトーのＨＰにある資料 http://www.atto.co.jp/pdf/Tips%20for%20WB.pdf に該当する症状はありませんか？

(無題) 削除/引用 No.17-6 - 2012/01/09 (月) 10:42:14 - qq 「でない病」は難しいよね。 二次抗体がかなりヘタっている可能性はないでしょうか？ かなり弱っていても強いシグナルであれば出るので、ヘタっている証拠を探すのが難しそうです。よそから二次抗体をもらってみるのはどうでしょうかね？

(無題) 削除/引用 No.17-5 - 2012/01/09 (月) 10:23:52 - う ありがとうございます。 ＞1)Prestained markerは正常にきれいに、泳動・転写されるか。 正常に泳動、転写されていました。loadingは普通になされており、また転写後メンブレンのタンパク染色を行いましたが、染色されていました。 ＞locking剤のロットが運悪く酷いものに当たったとき（溶け方が違うなと思った）や、洗浄液・希釈液等に使っていた(10x)PBSの作製ミス、PBS-Tにカビ？が生えていた等で、ウェスタンブロットが汚くなった経験はあります。もっとも、これらが主原因ではない可能性もあります。 その可能性も考え、新しいものを作り直しましたが改善ありませんでした。出来合いの ＞サンプルバッファーは還元剤が入っているものでしょうか？サンプルバッファーが古くて還元剤が効いてない可能性はないでしょうか？ サンプルバッファは出来合いのを購入して、サンプリング直前にメルカプトを入れてを使用しています。 使用している装置はBio-Radの一般的なものです。現像後のフィルムに、染みというか、転写装置のパッドに空いている小さい孔の輪郭のようなのが全体にでていたり、サンプルを不十分に融解して流したときのようにバンドの両端が凝集して濃くなり中心が薄くなる（サンプルは十分融解して遠心をかけて流しています）、現象が起こります。バイオラッドのパッド、以前の白いスポンジから、黒い荒い目のスポンジに変更されたので、その可能性も考え白いパッドも使いましたが、改善なかったです。 現在起こっている現象が文章では説明しづらいので、実際のフィルム画像をみていただければ一番いいのですが・・・。

(無題) 削除/引用 No.17-4 - 2012/01/09 (月) 09:53:52 - yyy サンプルバッファーは還元剤が入っているものでしょうか？ 蛋白によっては十分に還元されてないときれいに流れないものもあるのですが、 サンプルバッファーが古くて還元剤が効いてない可能性はないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.17-3 - 2012/01/09 (月) 09:17:34 - mon 問題点を切り分けるしかないのでは？ (1)Prestained markerは正常にきれいに、泳動・転写されるか。 正常なら、それ以降のblocking,検出に異常があると推測されます。 通常のマーカーでも良いと思います。膜上のタンパクの染色法はいろいろあります。 (2)たとえば、Invitrogen社のMagicMark XP サイズマーカーは、HRP標識(２次）抗体が直接結合しますので、これを使えば、1次抗体以外（blockingや洗浄液、２次抗体、検出液）に問題がないか判断できると思います。 また、blocking剤のロットが運悪く酷いものに当たったとき（溶け方が違うなと思った）や、洗浄液・希釈液等に使っていた(10x)PBSの作製ミス、PBS-Tにカビ？が生えていた等で、ウェスタンブロットが汚くなった経験はあります。もっとも、これらが主原因ではない可能性もあります。

(無題) 削除/引用 No.17-2 - 2012/01/09 (月) 08:21:56 - う ＞抗体によっては全くでないこともあります。 ＞サンプルの種類自体も今まで使用しているもので、抗体も使えることが確認されている物です。 ？どういうことでしょう？ ＞サンプル処理、ゲル作成、ウエスタン装置・方法など細かいことを含めて以前から変更していません。 以前の知らない、我々は、今も推量できません。

ウエスタンがうまくいかなくなった 削除/引用 No.17-1 - 2012/01/09 (月) 01:30:25 - う いつも参考にさせていただいます。 一年近く前よりWBがうまくいかないことが起こりだし、最近は今まで検出できていたものまでできなくなっています。 言葉で説明するのは難しいのですが、バンドが検出されても、バンドの一部が凝集、欠損している、むらがある、など今まで起こったことのない現象に悩まされています（実際にメンブレンを見てもらえれば良いのですが・・・）。抗体によっては全くでないこともあります。サンプル処理、ゲル作成、ウエスタン装置・方法など細かいことを含めて以前から変更していません。サンプルの種類自体も今まで使用しているもので、抗体も使えることが確認されている物です。 装置の汚れやメンブレン、抗体のロットなど疑い、別のものに変えても改善されません。考えられることは一通り確認しましたが、上手くいまず困っています。 このような経験がある方がいればご意見を聞かせていただければ幸いです。

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