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(無題) 削除/引用 No.1700-9 - 2013/05/03 (金) 03:54:20 - 独り言 > > 理由はiPSで発現していないので、2AでつなげるとNeoで選択できないということです。 > てっきり、分化した細胞をneoで選択してくるのかと思っていたんだなぁ。

(無題) 削除/引用 No.1700-8 - 2013/05/03 (金) 03:01:44 - ossi 少し手間はかかりますが、 pCAG-RFP-polyAみたいなRFP発現カセットを用意して、 特定の遺伝子---2Aペプチド---蛍光タンパク(Venus)---loxP---RFP発現カセット---loxP---特定の遺伝子の3'UTR として、RFP陽性細胞をFACSで回収後、Creを一過的にトランスフェクションしてRFP発現カセットを飛ばし、RFP陰性細胞を回収するのではどうですか?

(無題) 削除/引用 No.1700-7 - 2013/05/02 (木) 13:09:08 - かわさき 皆様へ。 自己解決しました。2AペプチドでNeo耐性遺伝子をつなげるのはこの場合ダメという結論になりました。 理由はiPSで発現していないので、2AでつなげるとNeoで選択できないということです。 同様の理由でIRESも使えません。 皆様、いろいろとありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1700-6 - 2013/05/02 (木) 10:12:49 - かわさき 皆様へ。 いろいろと情報ありがとうございます。 目的をもう少し詳しく書かせて頂きます。 研究のゴールとしてはiPS細胞から目的の細胞を分化誘導することです。その目的の細胞のマーカーが現時点で存在しないために試行錯誤している状態です。 特定の遺伝子というのは発生段階におけるある特定のリニエージのマーカー遺伝子です。今回GFPをその下流に2AでつなげようとしたのはiPSからまずはそのマーカーを発現するリニエージにさせて、FACSでソーティングして、さらに誘導をかけて目的の細胞にするということを考えているからです。特定の遺伝子が転写因子であるため、このような方法でしかソーティングが難しいと思われます。 ご指摘のあった件で、蛍光タンパクが２倍や３倍程度ではあまり効果がないという件、確かにうなづける話です。その辺はログで効いてくる部分ですからね。 Venusについては確かに明るい蛍光タンパクなのですが、うちの持っているAriaでは使えないらしいので、候補から外していました。 あと2Aで切れない（スキップされない）件ですが、確かに融合タンパクがなんかよからぬfunctionをgainする可能性は気持ち悪いですね。うーんって感じです。 あとNeo耐性遺伝子をプロモーター、CDS、ポリＡシグナルのカセットでいれるのと、2Aでつなぐのと、IRESでつなぐのと、どれが一番良いのか、迷いますね。経験がないので・・・。

(無題) 削除/引用 No.1700-5 - 2013/05/02 (木) 04:29:12 - 独り言 その特定遺伝子を完全に蛍光タンパク質-Ires-ネオマイシンもしくはネオマイシンだけにしたほうが確実な気がするなぁ。だってヘテロで発現が見れるからなぁ。 だって、その特定遺伝子と変に蛍光タンパク質とネオマイシンのフージョンタンパク質ができて、gain of functionしちゃったら気持ち悪いからねぇ。 で、ついでに用事があれば、ホモにして、その特定遺伝子のKOも研究しちゃうとか。iPSだからそこまでは求めていないかなぁ。 僕は2Aペプチド使用したことなから、実際にどちらがいいのかわからんけどねえ。

(無題) 削除/引用 No.1700-4 - 2013/05/02 (木) 04:03:17 - おお >[Re:1] かわさきさんは書きました : > また発現量が少ない遺伝子の場合に、蛍光タンパクの発現量を増やすべく蛍光タンパクを2Aペプチドを挟んでタンデムにつなぐようなことをされた方はいらっしゃいませんでしょうか？ 蛍光蛋白を発現確認に使うなら単純にスペーサーをかましてタンデムにつないじゃえばいいんじゃない。

(無題) 削除/引用 No.1700-3 - 2013/05/02 (木) 03:30:14 - アメリカポスドク 蛍光蛋白のタンデム数を増やすより、より明るい蛋白VENUSとかを使った方がよいかと。

(無題) 削除/引用 No.1700-2 - 2013/05/02 (木) 02:54:21 - 独り言 2Aペプチドかぁ。最近はいろいろあるんだなぁ。 どちらにしても、こういうものは配列依存的にうまくいくときといかないときがあるから、どちらにしても培養細胞で試してみた方がいいんだなぁ。 欲張らずに、蛍光タンパクはなしで、IRES-ネオマイシンとかも考えた方が良いのかもなぁ。 ちなみに酵母ならgfpを3個とか数個も繋げることがあるけど、ほ乳類だと見た事ないんだなぁ。そもそも2倍になったぐらいでは、それほど有用ではないんだなぁ。

ターゲッティングベクターのデザインについて 削除/引用 No.1700-1 - 2013/05/01 (水) 17:33:40 - かわさき いつも勉強させてもらっています。 過去ログなども多少は調べたのですが、ちょっと検索できませんでしたので、質問させて頂きます。 今回TALENにて特定の遺伝子に2Aペプチドをつないで蛍光タンパクを発現させるためのターゲッィングベクターをデザインしております。iPS細胞にてノックインするのですが、分化させて初めて発現し、ノックイン直後には発現しない可能性が高いことが予想されています。そこで蛍光タンパクの下流にネオマイシン耐性遺伝子の発現カセットを組み込むことにしました。 我々の研究室はクローニングはあまり得意ではないため、最近安くなってきている人工遺伝子のお世話になろうと思っています。 その際、ATリッチ配列では合成がやや難しくなるとのことで、すこしでも短く、ATリッチ配列を少なくするべく 特定の遺伝子---2Aペプチド---蛍光タンパク---2Aペプチド---ネオマイシン耐性遺伝子---polyadenyl signal というデザインを考えました。iPSの樹立に４因子を2Aペプチドでつないで一つの転写単位とする論文がありましたので、それをまねたわけです。ただ実際にうまくいくかが多少心配です。このようなデザインでやっておられる方がおられましたら、うまくいくかどうかなど情報をいただけませんでしょうか？ また発現量が少ない遺伝子の場合に、蛍光タンパクの発現量を増やすべく蛍光タンパクを2Aペプチドを挟んでタンデムにつなぐようなことをされた方はいらっしゃいませんでしょうか？ ご教授いただけましたら助かります。

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