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(無題) 削除/引用 No.1704-7 - 2013/05/09 (木) 10:46:29 - ~ 最終的にしたいことがよくわかりませんが、 Co-IPで結合を示すのではなく、AとBのコンプレックス自体が欲しいのでしょうか。 そうであればAはAで精製して、BはBで精製し、 精製した両者を混ぜてできたコンプレックスをゲルろ過などで回収した方が効率がいいのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1704-6 - 2013/05/08 (水) 21:57:21 - モモ 抗原と抗体の結合は強いので、それをはがす条件だとAとBの結合も外れそうですね。

(無題) 削除/引用 No.1704-5 - 2013/05/06 (月) 16:10:49 - おお とうでんてん電気えい動や、ネイティブ電気えい動などのほうがいいのでは、、、 プレパラティブなとうでんてん電気えい動そうちはバイオラッドとかがうってます。 ネイティブの電気エイ動などで装置で蛋白を回収できる装置はアトーがだしてたかなぁ。 あとはくろまとでフラクションをわけるとか、、、 そういうほうが現実的です。 タグをつけて発現させタグがプロてあーぜなどで切り離せるとかいう方法もありますが(これは既にして気がありますけど) TAP-tag purificationとか一時話題になりましたね。

(無題) 削除/引用 No.1704-4 - 2013/05/06 (月) 15:46:49 - ツブ ２個のタンパク質(AとB)が結合することがin vivo で解っていて、 その複合体を精製したいと思っています。 手元にAとBに対するポリクローナル抗体がそれぞれあるので、 それら２個の抗体（２度の免疫沈降）を用いて精製度を 上げようと考えて次第です。 >[Re:3] おおさんは書きました : > けっこう難しいのであまりやられていないほうほうだとおもいますが、、、 > pH、塩濃度、デタージェントの相性などが可能性があると思いますけど。ethanolamineも使われることはあるなぁ。後はDTTなどの還元剤をガンガンに加えるか(それでもけっこう頑丈なようですが)。 > 変性までもいかないかもしれませんが、かなり強い処理がひつようかと。なので蛋白相互作用はかなりなくなっているのではないかとおもいます。 > > へんせいさせていいのであれば、うれあとか、高濃度LiClかMgCl2などがやりやすいかもしれません。はがしたあと透析できますから。ただ、LiClとかMgCl2だともしかしたら、透析後抗体がアクティブになっているかもしれませんね。 >[Re:2] 独り言さんは書きました : > TEVサイトを導入しておいて、TEV酵素で切断かなぁ。 > > もしくはその抗体がモノクロなら抗原部位のペプチドを使って溶出だろうなぁ。 > > そもそもどういう目的で2回行うのかなぁ。もしかして内在性のタンパク質の話をしているのかなぁ。

(無題) 削除/引用 No.1704-3 - 2013/05/02 (木) 23:37:53 - おお けっこう難しいのであまりやられていないほうほうだとおもいますが、、、 pH、塩濃度、デタージェントの相性などが可能性があると思いますけど。ethanolamineも使われることはあるなぁ。後はDTTなどの還元剤をガンガンに加えるか(それでもけっこう頑丈なようですが)。 変性までもいかないかもしれませんが、かなり強い処理がひつようかと。なので蛋白相互作用はかなりなくなっているのではないかとおもいます。 へんせいさせていいのであれば、うれあとか、高濃度LiClかMgCl2などがやりやすいかもしれません。はがしたあと透析できますから。ただ、LiClとかMgCl2だともしかしたら、透析後抗体がアクティブになっているかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.1704-2 - 2013/05/02 (木) 20:11:26 - 独り言 TEVサイトを導入しておいて、TEV酵素で切断かなぁ。 もしくはその抗体がモノクロなら抗原部位のペプチドを使って溶出だろうなぁ。 そもそもどういう目的で2回行うのかなぁ。もしかして内在性のタンパク質の話をしているのかなぁ。

免疫沈降 削除/引用 No.1704-1 - 2013/05/02 (木) 18:22:38 - ツブ 免疫沈降を２個の抗体（自前で作製）を用いて行いたいと思っています。 １個目の抗体でIPした後、どの様に抗体とタンパクを剥がして、２個目の抗体のIPに供するのでしょうか？ この辺について教えて頂ければ幸いです。

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