Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る | トピック一覧 | 研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム(readのみ)

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

Detergent トピック削除
No.1707-TOPIC - 2013/05/03 (金) 09:23:12 - IP
Immunoprecipitationに向けて293細胞のlysis bufferのconditionを検討中です。そこでnaiveな質問があります。基本的に1%のNP40でいこうと考えているのですが、このdetergentの濃度でnucleoplasmの可溶性蛋白も回収されるでしょうか?このconditionは一般的には蛋白間の結合をpreserveしつつもplasma membraneを破壊して細胞質の蛋白を回収する手法だと思いますが、目的のたんぱく質がnucleoplasmにありそうなのでこの疑問に行き着きました。C/NのフラクションにわけてそこからIPというのも一般的だと思いますが、1%NP40が核膜も壊してくれるのであればあえてC/Nに分ける手法を使わないので簡便かと考えました。Detergentの濃度と細胞、または核膜に相性のようなものなどあるものでしょうか?
 
- このトピックにメッセージを投稿する -



7件 ( 1 〜 7 )  前 | 次  1/ 1. /1


(無題) 削除/引用
No.1707-7 - 2013/05/08 (水) 22:04:35 - モモ
核内蛋白の共沈なら塩濃度を検討するのが一般的な気がします。

(無題) 削除/引用
No.1707-6 - 2013/05/03 (金) 18:43:37 - おお
>このconditionは一般的には蛋白間の結合をpreserveしつつも

そう決めてかかると危ういです。

>plasma membraneを破壊して細胞質の蛋白を回収する手法だと思いますが、

核膜もかようかはします。なのでその条件で核たんぱく質を溶出している文献はいっぱいありますよ。

誤字訂正 削除/引用
No.1707-5 - 2013/05/03 (金) 15:45:13 - 月詠
なぜか免疫がすべて免役と誤変換されていました…。
大変失礼いたしました。。。

ここで尋ねるより文献を探したほうが早いのでは^^; 削除/引用
No.1707-4 - 2013/05/03 (金) 15:40:40 - 月詠
目的とする膜タンパクが界面活性剤の作用で、可溶化画分に抽出されてくるのか不溶画分に残留するのかは、免役沈降法においては「naiveな」というよりは根本的な問題だと思います。

一般論として、それぞれの界面活性剤の効果は、細胞膜や核膜の脂質構成や膜タンパク質構成、あるいはリピッドラフトなどの局所構造の影響等を受けるでしょう(つまり相性がある)。

ですから免役沈降法での解析を始めるにあたっては、まず目的とするタンパク質を(高次構造を大きく変性させずに)可溶化分画に溶出しうる界面活性剤(および処理濃度)を探すことから始めるわけです。
そのための代表的な界面活性剤のセットも数社から市販されています。

まずは関連文献を集めて、ヌクレオプラズムに集積していることが明らかになっている他のタンパク質を免役沈降法で解析している文献でどのような可溶化剤を用いているか調べてみれば、質問者さんの実験でも有効な界面活性剤が見つかることと思います。

既報・先例がない実験系なのであれば、質問者さん自身が、目的としているタンパク質を可溶化画分に溶出しうる界面活性剤を予備実験でスクリーニングするしかありません。免役沈降法の対象にしうるタンパクであれば、ウェスタンブロット法で簡単に確かめられるはずです。


それと核膜画分と細胞膜画分は簡単に別けれるのに、あえて混ぜて解析する意味がわかりません。ただでさえ免役沈降法では可溶化されたバッファー環境という非生理的条件におけるタンパク間相互作用を観察しているにすぎないわけですから、そこに本来は核膜上に存在しない細胞膜タンパクまで混在させてしまったら益々生理的条件ではありえないようなタンパク間相互作用(いわゆるアーティファクト)を観察してしまうリスクが増えてしまうだけではないでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.1707-3 - 2013/05/03 (金) 13:50:39 - おお
その蛋白はほかの研究グループとかが何か実験をやってないのでしょうか?

そうでなければ、まあ条件決めをご自身でやる方がいいですね。1%NP-40で溶出するたんぱくもあればしない蛋白もあります。

(無題) 削除/引用
No.1707-2 - 2013/05/03 (金) 10:23:03 - み
お試しになったら良い。
そのbufferで可溶性画分と不溶性画分を分取し対象蛋白を検出する。
ポジコンもあるとなお良い。

Detergent 削除/引用
No.1707-1 - 2013/05/03 (金) 09:23:12 - IP
Immunoprecipitationに向けて293細胞のlysis bufferのconditionを検討中です。そこでnaiveな質問があります。基本的に1%のNP40でいこうと考えているのですが、このdetergentの濃度でnucleoplasmの可溶性蛋白も回収されるでしょうか?このconditionは一般的には蛋白間の結合をpreserveしつつもplasma membraneを破壊して細胞質の蛋白を回収する手法だと思いますが、目的のたんぱく質がnucleoplasmにありそうなのでこの疑問に行き着きました。C/NのフラクションにわけてそこからIPというのも一般的だと思いますが、1%NP40が核膜も壊してくれるのであればあえてC/Nに分ける手法を使わないので簡便かと考えました。Detergentの濃度と細胞、または核膜に相性のようなものなどあるものでしょうか?

7件 ( 1 〜 7 )  前 | 次  1/ 1. /1


パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール   アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存(次回の入力の手間を省けます)
上に上げない(トピックの一覧で一番上に移動させません)
解決(問題が解決した際にチェックしてください)
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 

〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。