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ノックアウトマウスの細胞で発現 トピック削除
No.1709-TOPIC - 2013/05/03 (金) 17:04:19 - あ
A遺伝子のノックアウトマウスの細胞にタグの付いたBタンパクを発現させて局在(蛍光顕微鏡)を調べるように指示されています。タグ付きBタンパクの発現プラスミドとレトロウイルスはすでに有り、ノックアウトもすぐ利用できます。
細胞種は特に指定されていないのですが、手早く済ますにはどういう細胞が良いでしょうか。MEFを作ることも可能ですが、2週間+αかかると思いますので、何か適当な細胞と方法がありましたら教えて下さい。
 
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(無題) 削除/引用
No.1709-7 - 2013/05/06 (月) 13:36:47 - 月詠
ただ、「どの実験系を用いるかは、得られた実験データの(研究全体の中での)意義を左右する」重要事項ですので、実験系の選択については、本来的には実験を指示する側(その研究全体をプラニングしている研究者)がきちんと決定しておかなければならないことだと思います。
なんでもいいから早く、っていうのはいくらなんでもあまりにもおざなりです(そういう意味では、下請けに丸投げしすぎ、ですよね…^^;)。

質問者さんは技術補佐員やテクニシャンの立場のようですので、(研究上の)どのような文脈で用いるデータを必要としているのかを、実験を指示した人に確認した上で適当な実験系を検討してもらってください。

系を選択するときには実験の目的を踏み外さないように… 削除/引用
No.1709-6 - 2013/05/06 (月) 13:22:57 - 月詠
手早くと申しますけど、、どのような実験系を選択するかは、実験の目的とタンパク質Aやタンパク質Bの性質を考慮して選択する必要があるのではないでしょうか。

たとえばタンパク質Bの生理的な条件での細胞内局在を観察したいということであれば、なるべくそのタンパク質Bが高発現している臓器の細胞を選択するべきだと思いますし、単になにか別の因子のアッセイ系を確立するだけであれば、たとえ本来の発現細胞や細胞内局在と異なっていてもアッセイ系として機能してくれさえすればそれでいいわけです。

質問者さんが指示されている実験では、「遺伝子Aを欠失したとき(=タンパク質Aが発現していないとき)に、タンパク質Bの細胞内局在に変動があるか確認する」のが研究の目的のようですので、元々タンパク質Aとタンパク質Bが共発現している臓器の細胞で観察しないと、意味のあるデータにはならないのではないでしょうか?


過剰発現させた時点で非生理的条件になっているから、そんな条件下での細胞内局在を観察したって意味がない、と意地悪な指摘をされてしまうとそれまでですけど…。

(無題) 削除/引用
No.1709-5 - 2013/05/06 (月) 08:50:29 - 1
tail-tip fibroblastではどうですか?
個体を殺さずに済みます。
レトロウイルスの感染も大抵はよいはずです。
ただ、1個体あたりの細胞数があまり取れないのと、
すぐ老化するんで、なるべくフレッシュなものを使う必要がありますが。

(無題) 削除/引用
No.1709-4 - 2013/05/04 (土) 02:15:09 - おお
>[Re:3] あさんは書きました :
> HeLaやHEK293などを使って本来の発現細胞とは違ってもトライアル的に当たりをつけることはよくやると思うのですが、やはりMEFでしょうか

それはあなたの実験目的、ベクターがどの程度エスタブリッシュされているものか、局在について何かすでに情報があるかなど、にもよると思いますのでお答えするのはむずかしいです。局在を見るということは何かマーカーの染色が同時に必要になるかもしれませんよね。


押し問答になるかもしれませんが

"A遺伝子のノックアウトマウスの細胞にタグの付いたBタンパクを発現させて局在(蛍光顕微鏡)を調べるように指示されています。"

といわれているのでそれにおこたえしたのであって、、、、


ベクターが働いているかどうかきになるというのであれば、まあセルラインでやっても良いかと思いますが、それなら3T3とかでやったほうがいいのかもしれませんし、MEFを使う時同時にやってもいいですよね。

(無題) 削除/引用
No.1709-3 - 2013/05/04 (土) 01:52:42 - あ
HeLaやHEK293などを使って本来の発現細胞とは違ってもトライアル的に当たりをつけることはよくやると思うのですが、やはりMEFでしょうか

(無題) 削除/引用
No.1709-2 - 2013/05/03 (金) 17:41:40 - おお
何でもいいからやればいいというようなもんなんでしょうか、、、そう言う意味ではちょっと書くのは気が引けますが、、、

けいけんはないのですが、脾臓からモノサイトとかはかなり樹立された方法ではないでしょうか。サブタイプを気にしないなら、抗体ビーズとか無縁ですし。

あとMEFでもいいんじゃないでしょうか?プライマリーの状態で感染してしまえば、樹立までしなくっても発現した状態で観察できますよね。

ノックアウトマウスの細胞で発現 削除/引用
No.1709-1 - 2013/05/03 (金) 17:04:19 - あ
A遺伝子のノックアウトマウスの細胞にタグの付いたBタンパクを発現させて局在(蛍光顕微鏡)を調べるように指示されています。タグ付きBタンパクの発現プラスミドとレトロウイルスはすでに有り、ノックアウトもすぐ利用できます。
細胞種は特に指定されていないのですが、手早く済ますにはどういう細胞が良いでしょうか。MEFを作ることも可能ですが、2週間+αかかると思いますので、何か適当な細胞と方法がありましたら教えて下さい。

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