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(無題) 削除/引用 No.1720-26 - 2013/05/16 (木) 21:27:44 - おお それも気になるんだけど、それだけで実験の正確なバックグランドがはかれているかもちょっと不安なので、でんきえいどうでみてみる方法を提案したのだけど、、、

(無題) 削除/引用 No.1720-25 - 2013/05/16 (木) 17:26:58 - mbb PBSだけで測定 ってのはしているんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1720-24 - 2013/05/14 (火) 10:54:55 - R >RNAではないといけないのでしょうか?小分子といいますけど、、、 >小さいサイズの分子なら何でもいいというわけではなく >ＲＮＡをターゲットに研究を行っています RNAを放出させるための小さな穴を開けることが目的かと思いましたが。 >私の試薬で細胞に小さな穴をあけた。それをＲＮＡ放出量で比較した。 >RNAの量では、私の試薬の有効性は示せないような気がしてきました RNA程度のサイズの分子が通る穴をあけることが目的？ microRNAだと穴が開かなくてもエクソソームで放出ともされていますよ。

(無題) 削除/引用 No.1720-23 - 2013/05/14 (火) 10:52:02 - AA RNAの検出系の感度がどの程度なのかによる気もします。 感度が高ければ常にある程度のバックグラウンドが出るので、「0か100か」という評価は難しいと思いますし、 逆に感度が低ければシグナルとしては「0か100か」になりますが、偽陰性が疑われるでしょう。 月詠さんの意見のとおりですが、 バックグラウンドではある程度の量しかないPBS中のRNAが、 試薬の添加によって十分量増えるというのが良いのではないかと思います。

本題に戻って 削除/引用 No.1720-22 - 2013/05/14 (火) 09:55:39 - RNA量 みなさん いろいろと貴重なご意見ありがとうございます すこし本題にもどらせていただくと、私の試薬で細胞に小さな穴をあけた。それをＲＮＡ放出量で比較した。でも未処理の細胞からＲＮＡがでてくる。 こうなると、RNAの量では、私の試薬の有効性は示せないような気がしてきました。 どうしてもＲＮＡで評価したい場合は、未処理の細胞にRNAseを振り掛ければいいでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1720-21 - 2013/05/13 (月) 22:40:56 - 直輝 フィルターの話は、どうやら本論からズレてそうですね。 一応、バイオアナライザーでリボソームRNAのピークをチェックしながら試したことはありますけど、シリンジを使って手動でフィルター通したぐらいでは細胞は死なないぽいですよ。 もちろん、圧をかけたらダメなので、遠心後の上清に限りますけど。

ご返答 削除/引用 No.1720-20 - 2013/05/13 (月) 22:36:40 - RNA量 おお様 いつもアドバイスありがとうございます 私の記載がよくなったみたいです 小さいサイズの分子なら何でもいいというわけではなく ＲＮＡをターゲットに研究を行っています 訂正まで

(無題) 削除/引用 No.1720-18 - 2013/05/13 (月) 22:21:07 - おお てっきり、RNAが検出されることでそのあっせいの信憑性、読んだ人がもつ印象を気にしていらっしゃるのかとおもったのですが、、、 RNAではないといけないのでしょうか?小分子といいますけど、、、まあちいさいRNAもいがいとアバンダントでありますが、、、 細胞に穴をあけるけどダメージがないというのが微妙ですが、、、まあなにかそう言いえるものや方法を開発されているのでしたらとやかくいうことはないですけど、、、 たとえばneutral redは生細胞では取り込まれるので、取り込ませておいて洗い流し、その処理で出てくるなら穴が開いているといえるのではないでしょうか。またトレパンブルーなどはmembrane integrity がなくなると細胞内に侵入しますので穴が開けばはいるはずです。蛍光しきそでもそのようなものがいくらかありますね。DAPI. PI etc ただこのようなあっせいは細胞の生死判定に使われるので、ほかのデーターで生きていることをバックアップしておかないといけないとはおもいますが、、、

ご返答　 削除/引用 No.1720-17 - 2013/05/13 (月) 21:45:35 - RNA量 月詠様　おおさま お世話になっております （１）予想に反して・・・私は細胞をＰＢＳ中に入れておくだけでＲＮＡが検出されるとは思ってもいませんでした。これが予想に反してという意味です。でも皆様のご意見で、細胞にダメージがある、マイクロＲＮＡなどなどいろいろな要因が考えられることがわかりました （２）私の試薬・・・界面活性剤なのですが、細胞へのダメージはないかと思っています。でもtweenやtritonみたいに穴は空いて、ＲＮＡなどの小分子は出てくるかと思ってＲＮＡの定量を試みています （３）月詠さま・・・たしかにおっしゃるとおり、比を取ってみるのはいいアイデアですね みなさんありがとうございます

(無題) 削除/引用 No.1720-16 - 2013/05/13 (月) 19:00:20 - 月詠 あなたの実験の目的は、「抽出試薬の有効性の確認」のようですから、たとえば、細胞中の全ＲＮＡを１００としたとき、 �@未処理群（陰性対照）：遠心上清中に１（バックグラウンド値）、細胞ペレット側に９９ �A抽出処理群（実験群）：遠心上清中に９０、細胞ペレット側に１０ くらいになっていれば抽出効率としては問題ないのではないですか？ なのに「予想に反して多い」というのはどういうことでしょうか？ 未処理群で、遠心上清中に３０、細胞ペレット側に７０くらいの比になっていたりするということでしょうか？ 「培養直後の培養上清」と「回収してＰＢＳで遠心洗浄後の遠心上清」を比較して、明らかに洗浄後の遠心上清中に多量のＲＮＡが検出されているのでしょうか？ 開発中の抽出試薬のようですけど、細胞の種類や培養方法等、もう少し情報をいただかないと（いろいろな可能性がありすぎて）なにが起きているのか判断のしようがないと思います。

(無題) 削除/引用 No.1720-15 - 2013/05/13 (月) 15:40:06 - おお わたしもフィルターしたときに壊れるのが心配だなぁとおもいましたが。

(無題) 削除/引用 No.1720-14 - 2013/05/13 (月) 15:38:09 - おお Bromophenol Blue ローディングバッファーにはいっている青い色素です。濃い方。

(無題) 削除/引用 No.1720-13 - 2013/05/13 (月) 15:31:00 - ちょろ フィルターすれば壊れた細胞を圧力で増やすと思う

BPBって何でしょうか？ 削除/引用 No.1720-12 - 2013/05/13 (月) 15:12:10 - RNA量 おおさま ＢＰＢって何でしょうか？ すいません 勉強不足です

(無題) 削除/引用 No.1720-11 - 2013/05/13 (月) 13:52:38 - おお たぶんスタンダードをとって定量しているのだと思うのですが、、、そういうので検出できるほどRNAがあるのかなぁっと、、、そうすると蛍光はなにがしかのバックグランドかもしれないし、、、 たとえば6%ぐらいのPAGEでBPBがwellからすこし離れるぐらいで染めて蛍光が検出されるでしょうか。検出されるとしてRNase処理してからながすとしたにシフトしたり、消失したりしますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1720-10 - 2013/05/13 (月) 09:27:17 - Q すでに細胞が壊れていて、RNAが放出されていたら フィリターは意味ないんじゃないのかなぁ。

ありがとうございます 削除/引用 No.1720-9 - 2013/05/08 (水) 22:57:28 - RNA量 直輝さま ありがとうございます！！ 御礼まで

(無題) 削除/引用 No.1720-8 - 2013/05/08 (水) 22:50:47 - 直輝 細胞が無傷というのを保証するのは難しいですが、細胞を１個も含まないということなら、遠心した培養上清をさらにフィルター(0.45um)に通せば実現できます。

なるほどたしかに 削除/引用 No.1720-7 - 2013/05/08 (水) 22:18:07 - RNA量 ｑｑさん確かにそうですね。細胞が無傷である保証はないですし、遠心して ペレットにしているとはいえ、吸っていないという保証はないですね ももさん まずは簡単に試薬の効果を見たいために ＲＮＡはＳＹＴＯ−ＲＮＡという試薬で発色させて蛍光強度を測定しています

(無題) 削除/引用 No.1720-6 - 2013/05/08 (水) 22:04:31 - qq ＞ＰＢＳに懸濁した細胞の上澄みを取って どうやれば、細胞に無傷で、細胞を1個も含まない上澄みを取ることができるのでしょうか？ そして、それをどのようにして証拠立てるのでしょう？ それが出来ないと、単に上澄みに細胞が混じっていたとか、細胞が傷ついて、RNAが漏れちゃったを否定できないと思いますが、いかがでしょうか？

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