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(無題) 削除/引用 No.176-8 - 2012/02/20 (月) 15:38:43 - toyo 「溶解バッファー（バッファー+NP40）」の内容が不明ですが、その方法はglycogen抽出を行う際の標準的な方法に従っていますか? 細胞からの抽出効率は大変計測しにくいので、アルカリボイル法や凍結融解など別の方法を用いた方がよいかもしれません。 感覚的な話で申し訳ありませんが、6-well plateの1 well(35mm dish)からのcell lysateをエタノール沈殿しても、目に見えるほどの大きさのglycogenペレットは生じないと思います。 バッファー中の塩などが濃縮されて析出しているのではないでしょうか。 例えば、この溶解バッファーのみ(細胞を含まない)に2倍量のエタノールを足したとき、白濁や沈殿が生じないことを確認されましたか? また、沈殿が生じる原因を明らかにするのもよいですが、glycogen測定が目的だとするならば、溶解バッファーに既知量のglycogenを添加して処理を行うことで、添加した量のglycogenが正しく測定できることを確認されてはいかがでしょうか。 また細胞のlysateに既知量のglycogenを添加した場合、添加した量のglycogenが正しく測定できることを確認されましたか?

Re. 無題 削除/引用 No.176-7 - 2012/02/20 (月) 14:45:32 - 大学院生 返信ありがとうございます。説明不足で申し訳ありません。 6-wellプレートで培養した細胞に100uLの溶解バッファー（バッファー+NP40）を加え細胞を完全に溶解しました。 その後、溶解液を遠心し得られた上清に対して、２倍量のエタノールを加えると白濁が生じました。 遠心して得られたペレットを100uLの純水に溶解させ、それをグリコーゲン原液としました。 これを10uL用いて、ご返信にありますようなグリコーゲンアッセイキットで測定しようと考えていました。しかしその前にグリコーゲン原液が作れないという状況です。 生化学の教科書や、Web上で情報収集したところではこの段階で完全に溶解できるようですので原因が分からず、今回の投稿に至りました。

(無題) 削除/引用 No.176-6 - 2012/02/20 (月) 14:09:29 - ~ 検出限界以下でしたか。 ところで、まだ方法を書かれていませんが、酸や酵素の処理が不要な系なのでしょうか？ 処理していないために、グルコース濃度が低くて測定できていないだけではありませんよね？

Re.どこからその測定系を持ってきたの？ 削除/引用 No.176-5 - 2012/02/20 (月) 12:34:35 - 大学院生 返信ありがとうございます。 現在の希釈率では検出限界以下である可能性が高いと考えられますので、原液に近い状態で再度トライしてみようと思います。 なお今回TCA溶解は行わず、サンプル（界面活性剤入りバッファーに細胞を溶かし出したもの）に直接エタノール沈殿をかけました。ここにも問題が有りそうです。

(無題) 削除/引用 No.176-4 - 2012/02/20 (月) 12:23:06 - toyo ＞溶解しきれなかった分を一旦遠心し、その上清中のグリコーゲン定量をおこなったところ、グリコーゲンは比色計での検出限界を切ってしまいました。やはり溶解しきれていない部分にグリコーゲンが含まれているということでしょうか？ 検出限界を切ったという表現が、検出上限以上だったのか下限以下だったのかがわかりにくいです。 後述の文章からは、検出下限以下だったように思えますがOKですか? グリコーゲンの測定には様々な方法が用いられますので、質問者さんの測定系についての詳細を記述していただかないと、沈殿の内容が推測できません。 グリコーゲン自体は可溶性が高いので、少々の沈殿であればピペットの先で破砕することでグリコーゲンが溶け出てくるように思います。 次に、培養細胞のグリコーゲン含有量は組織と比べて大変少量であるようで、組織向きの方法が培養細胞でも使えるとは限りません。 例えば、HepG2の平均的なグリコーゲン含有量は、6cm dishにconfluentな状態で1〜10ug程度のオーダーかと思います。 一方、Anthrone硫酸法は組織向きの古典的な測定法で、エタ沈による濃縮処理の際にNa2SO4の沈殿が生じるかと思いますが、この方法は検出下限が6ug/ml程度なので、条件によっては検出自体が難しいと思います。 他の方法としては、グリコーゲンを酵素反応によりグルコースに変換して定量するキットなどがありますので、ご一考ください。 例 http://www.biovision.com/manuals/K646.pdf ## インスリン処理に伴うHepG2のグリコーゲン含有量の変化を ## 調べていらっしゃるようですが、以前私が試したときは ## 有意な差が見られなかったので、質問者さんの結果が気になります。

どこからその測定系を持ってきたの？ 削除/引用 No.176-2 - 2012/02/20 (月) 10:42:30 - ~ その測定系では、グリコーゲンが飽和濃度になっていることまで分かるのでしょうか？ また、グリコーゲン定量法では、TCA抽出等を行なった後に遠心して不溶成分を除く操作が入っているものが多いですが、それらとは原理が異なるのでしょうか？ >ペレットを水に溶かそうとしている >溶解しきれなかった分を一旦遠心し、その上清中 上清中のグリコーゲン濃度が、測定系の測定上限を超えていることと、 溶け切れない画分にグリコーゲンが含まれているかどうかは、別の問題だと思いますが。 グリコーゲンが飽和になっていることが分かっているのであれば、抽出する水の体積を増やし、飽和にならない濃度にまで希釈すればいいでしょう。 グリコーゲンが十分に溶解されていたとしても、2サンプルの両方ともが測定限界を振り切っているのであれば、定量出来ていないでしょう。 適当な濃度に希釈しなければ、成功している実験であったとしても結果が分かりません。

肝がん細胞HepG2中のグリコーゲン定量 削除/引用 No.176-1 - 2012/02/19 (日) 15:56:28 - 大学院生 HepG2細胞から細胞内グリコーゲンを定量しようとしています。 細胞溶解液に対して、エタノール沈殿を行い、その際生じたペレットを水に溶かそうとしているのですが、この時にどうしてもペレットを溶解し切ることができません。 溶解しきれなかった分を一旦遠心し、その上清中のグリコーゲン定量をおこなったところ、グリコーゲンは比色計での検出限界を切ってしまいました。やはり溶解しきれていない部分にグリコーゲンが含まれているということでしょうか？ インスリン処理したサンプルでも同様の結果になってしまったので、操作上に問題があると考えています。アドバイスをお願いできますでしょうか？

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