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(無題) 削除/引用 No.179-10 - 2012/02/27 (月) 12:43:19 - 名無し 私はマウス組織からのRNA抽出にQIAGENのRNeasy kitを使っています。 マウスの組織によってはRNeasy Fibrous Tissueを使います(筋肉と心臓)。 肺はRNeasy Plus mini kitで問題なくRNA抽出できます。 解剖後-80℃で保存(sac~-80℃に入れるまで約40分)。 メスや彫刻刀などで必要分を削り取って、抽出Bufferを加えポリトロンでホモジナイズ(氷上3min)。 DNA除去カラムがついてますが、DNase処理は念のため行っています。 260/280nmは1.9前後になります。 他のRNAグレードの検定は行っていませんが、問題ないと思います。

(無題) 削除/引用 No.179-9 - 2012/02/22 (水) 15:20:53 - ねず 更なるアドバイスをありがとうございます。 今日、実際にマウスの実験をしている者に聞くことができました。 動物舎にドライアイスを持参し、取り出した肺の組織はチューブに入れてすぐにそのドライアイスの中に入れたそうなので、私が心配していたより保存状態は良さそうです。 ただ、その組織を3つに切り分けて、凍結保存はその一つだそうですので、思っていたより小さいもののようです。 目的は、抗がん剤で小さくなった転移(どれくらい小さくなったのかはよくわかりませんが)をRTーPCRで確認するそうなのですが、もし転移がかなり縮小してその１／３の小片に含まれていなかったりすることはないのだろうかという気がしてきました。やはりあり得るでしょうか。 練習用に解剖できるマウスがないかも聞いてみたのですが、ないとのことでした。。。 どれくらい時間をかけて良いのかわかりませんが、待てるようならその間に必要でなくなったマウスが出てくれば練習したいと思います。わざわざ練習用のマウスを購入してもらえるかは微妙です。。。 プロジェクト責任者とはまだ相談していませんが、乳鉢やRNA抽出試薬など購入するとなると、今あるキアゲンのRNeasy Kitでやろうと言い出しそうな気もします。 今のラボには移動して半年ですが、その人は工程をあまり気にしないでデータだけを欲しがるタイプのようなので困ったものです。 実際どう進めていくかはまだわかりませんが、とても勉強になりました。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.179-8 - 2012/02/22 (水) 08:30:05 - C2J2 > ホモジェナイザーは、タンパクの実験で使っているものがあるので、それならラボにあります。ただ、これを使用する場合、どの程度行えば良いのでしょうか。 もう粉々になっているし、10-15秒程度で十分です（といっても結構長く感じますが）。どちらかというとDNAを切る目的の方が大きいです。チューブを氷入りのビーカーなどに入れて冷やしながらホモジェナイズするプロトコールもありますが、私はしていません。ただ、抽出試薬はオンアイスにしておいたものを使っています。 あと、私もjunkマウスで事前に練習することをお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.179-7 - 2012/02/22 (水) 08:17:45 - Harmonia ぼくは、乳鉢で液体窒素を入れてごりごりですが、No.179-3 のC2J2さんと違う点は、粉になったところで抽出試薬を少量ずつ乳鉢に入れ、（即凍りますが）抽出試薬も粉にしているところです。 そうすると、試料が解けた時にすぐに試薬に触れることができるので。

(無題) 削除/引用 No.179-6 - 2012/02/22 (水) 00:09:59 - uokaw 　実際のサンプルは貴重かもしれないですが、とりあえず新しくマウスを購入して練習してはダメなのでしょうか？ 　マウスの色々な組織（臓器？）を−８０度で冷凍し、解剖直後と冷凍処置後の組織（臓器？）からRNAを抽出してみれば、冷凍保存の影響がある程度わかりますよね。 　完全に冷凍される（＝RNaseが止まる）までと、解凍してから阻害剤（グアニジン系なのかフェノール処理なのか）が働くまでの間が、RNAが分解する可能性を考慮する時間です。冷凍されるまでの時間は今更短く出来ないので、気にするべきところはいかに早くRNaseを失活させるかにかかっていますよね。 　私も液体窒素で凍結―粉砕、そして組織溶解（RNaseを潰す）を第一選択にするでしょう。 　2nd choiceはホットフェノールに入れて可溶化速度を上げて対処するですかねー。 　仮にRNAが抽出できてRT-PCRが成功したとしても、凍結までの時間にRNAが分解していることは否定できません。それが本当に研究したい状態を反映した結果であるのか？対外的に自信を持って発表してもいいのか？ボスと相談しなければならない事は沢山あると思います。

(無題) 削除/引用 No.179-5 - 2012/02/21 (火) 16:44:00 - ねず レスありがとうございました。 普段ルーチンでやっているわけではないので、今回は練習するものがないのですが、コントロールのサンプルがいくつかあるようなので、それを一つ試しにやってみるしかなさそうです。 とりあえずRNA抽出試薬を加えて、凍結状態を保ったまま粉砕しないといけないようですね。 Pulverizer検索してみました。いいですね。今後も組織からのRNA抽出を行っていくようであれば、購入できないかボスに聞いてみたいと思います。 ホモジェナイザーは、タンパクの実験で使っているものがあるので、それならラボにあります。ただ、これを使用する場合、どの程度行えば良いのでしょうか。 あまり長くやりすぎると温度も上がってしまうので、小刻みに何度もやってみるしかないでしょうね。 乳鉢もないので、凍結させながら粉砕できる器具をまずは探してみます。粉砕後は組織をRNA抽出試薬に入れ、更にホモジェナイザーにかけ、抽出作業する、という方法で試してみようと思います。 レスをくださった方、ありがとうございました。 もしまだ不十分な点、注意点などがありましたら引き続きよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.179-3 - 2012/02/21 (火) 04:18:53 - C2J2 肺は繊維成分豊富なのでホモジェナイズが難しいです。 肺に限らず、組織の保存は液体窒素を使っています。破砕は液体窒素で冷却したステンレスのpulverizerを使い、粉々になった組織を掻き集めてRNA抽出試薬（TRIzol）またはタンパク抽出バッファーに放り込んでいます。さらにポリトロンホモジェナイザーでかき回せばDNAも切れるので扱いやすいです。直接ポリトロンだと、よほど丁寧にホモジェナイズしないと繊維成分が残ることが多いです。

(無題) 削除/引用 No.179-2 - 2012/02/20 (月) 14:07:16 - ~ 今の時点で練習できないのであれば、出来る状態になるまでRNA実験は止めた方がいいと思いますが… 違う組織の話ですが、 昔、組織を凍ったままホモジナイザーにかけて、溶かしながら粉砕しようとした時にはうまくいきませんでした。 その時は丈夫なビニール袋にRNA抽出試薬と一緒に入れて、金属の万力のような装置で挟み、ハンマーで叩いて粉砕し、速やかにRNA抽出試薬と混ぜて回収していました。 （脳と肺が同じやり方でいいのかは分かりません。ただ、凍結した肺でホモジナイザーを使って、RNA抽出を失敗したことはあります） 練習できない分を金でカバーできるのであれば、SKミルのような既製品を使うのもいいかもしれません。

マウスの肺からのRNA抽出 削除/引用 No.179-1 - 2012/02/20 (月) 13:40:53 - ねず マウスの肺からRNA抽出をし、逆転写し、RTーPCRを行う予定でいます。 組織からのRNA抽出は初めてで、練習や失敗ができない状況なのでこちらで伺わせていただいております。過去のトピを調べたところ、肺からRNA抽出に苦労されたというお話がありました。また、解剖後は即座にRNAlaterなどの試薬にいれて凍結保存するほうが良いようだということを知りました。 組織は、解剖後、ー80度に凍結保存されています。しかし、解剖したのは別の人で、動物舎からラボに戻って凍結するまで恐らく最低10分はかかっていると思います。RNA操作に詳しい人とは思えないし、プロジェクト責任者もきちんと指示をしたとは思えないので保存状況が良くない可能性が高そうです。各社から似た類の製品が出ていますが、効率よくRNAを抽出する方法として、お奨めの試薬またはKitがありましたら教えていただけないでしょうか。また、その凍結組織をまずは細かくする必要があるかと思いますが(解剖したままの状態で凍結されているようです)、注意点やコツなども教えていただけると助かります。 よろしくお願いします。

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