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(無題) 削除/引用 No.1818-6 - 2013/05/10 (金) 09:48:11 - マモさん ＞おおさん タンパク質の分子量は15 kDaほどなのでそんなに大きくないと思います。 ＞Harmoniaさん ありがとうございます。 参考にさせて頂きます。

(無題) 削除/引用 No.1818-5 - 2013/05/10 (金) 08:03:46 - Harmonia ベクターの違いについては、販売元のデータシートを参考にしていただく として、タンパク質発現の手助けになるサイトとして、下記の日本蛋白質 科学会のアーカイブをお勧めします。 http://www.pssj.jp/

(無題) 削除/引用 No.1818-4 - 2013/05/10 (金) 00:04:45 - おお そちらでのWBの感度を把握してませんが、抗体で引っかからないというのは経験上ないので、どこか根本的なところでmistakeがあるかもしれません。(失礼なれべるになりますが、、、IPTGで誘導しているかとか、そのコンストラクトがちゃんとしているかとか、たまたま変なクローンをひろったとか、、、) その蛋白の大きさはどれくらいでしょうか。おおきいと、全長より短いものが多く検出されることはあります。 ベクターのちがいは今確認していませんが、プロモーターLacl、RESからATGあたりまではオプティマイズされた配列を使っていると思いますのでそういじれるものではないかと、、、タグで変わりそうなところは可溶性とかではないかとおもいますが、、、それもドラスティックに変わらないことが多いですけど、、、 意図的にどうこうしてもあまり大きく変わらないことがおおいですが、ちょっとした違いで大きく変わることも全くないわけでもないですけど、、、

(無題) 削除/引用 No.1818-3 - 2013/05/09 (木) 23:30:21 - マモさん おおさん、返信ありがとうございます。 タンパク質の検出はHisタグ抗体を用いて行っています。 また、タンパク質の調整は、総タンパク質と可溶性タンパク質の両方 で行っています。

(無題) 削除/引用 No.1818-2 - 2013/05/09 (木) 22:50:00 - おお CBBでそめているならば、マイナーバンドで見落としているか、認識できない可能性があるとおもいますが、そう言う場合はウエスタンで検出すればいいかとおもいます。もしまだやっていなかったら。。。 また蛋白抽出の際、可溶化しなかったところにきている可能性はありませんか?まずはちょくせつ大腸菌をSDSPAGEのsample bufferで溶解してみるのもてかとおもいます。もしそうしてなかったら。。。 ベクターの違いは主についてくるtagのようですが、、、

大腸菌でのタンパク質発現 削除/引用 No.1818-1 - 2013/05/09 (木) 22:31:03 - マモさん 現在、Pet発現系を用いてタンパク質の発現系を構築しています。 使用しているベクターはPet30aです。 構築を行いタンパク質の発現を確認しましたが、発現しませんでした。 同じタンパク質を研究しているグループが出した論文を見ると、 Pet151ベクターを使用して、構築しています。 宿主は同じもの(BL21(DE3)Plys)を使用しています。 ベクターの違いでタンパク質の発現に差がでるのでしょうか? (同じPet発現系でも) また、Pet30とPet151ベクターの違いは何なのでしょうか? よろしくお願いします。

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