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(無題) 削除/引用 No.183-8 - 2012/02/22 (水) 08:25:55 - Harmonia > 別の手法 RNAを検出する別の手法、たとえばノザンブロッティングとかRNaseプロテクションとか。 また、「発現」では無く「蓄積」ですよね。 No.183-6 だと、他の領域では下がっていたというのだから、No.183-1で言っていたプライマーは、設計ミスかもということで。 で、reverse transcription のプライマーは何ですか？ Oligo(dT)にするかランダムにするか遺伝子特異的にするかで、検出のために設定したプライマーが「RNA」の量を語ってくれるかどうかは変わります。

(無題) 削除/引用 No.183-7 - 2012/02/21 (火) 22:00:53 - AP 確認ですが、導入したのはsiRNAとかshRNA（哺乳類細胞で使われるような）ではなく、ある程度の長さをもったdsRNAなのですよね。 だとしたら、分解されていないdsRNAが鋳型になってPCRがかかったという可能性は排除できないと思います。dsRNAのカバーする領域を挟むようにPCRをかけるとか、その領域内と領域外との間でPCRをかけてみたらどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.183-6 - 2012/02/21 (火) 18:37:23 - あああ ご回答ありがとうございます。 AP 様 ノックダウン領域内に、リアルタイムPCR用のプライマーを設計をしていますが、RNA接種後２日後にサンプリングを行ったので、RNAは分解されたと考えています。（RNA干渉に関わる遺伝子はdsRNA接種後１日目に高い発現を示しました。） こういった設計では問題でしょうか うんと 様 プライマーの組み合わせを変え、半定量解析を行ったところ、コントロール区よりも発現が低下するという結果が得られ、ノックダウンは成功していた様です。 分解されたdsRNAの破片が残留していたのでしょうか？ 発現が増加した原因はまだよくわからないです。

(無題) 削除/引用 No.183-5 - 2012/02/20 (月) 23:06:32 - うんと 他の可能性としては、 実はノックダウンしたら、別の遺伝子の発現が上昇して その別の遺伝子を偶然にもqPCRで増幅していたとか。 qPCRで増幅したのが、本当に目的遺伝子なのかどうかを シークエンスを実際に読んで再度確認してはいかがでしょうか。 あと、ノックダウンに使ったdsRNAのターゲットは一か所のみでしょうか？ 培養細胞なんかの実験だと、複数のターゲット配列（２〜４か所）を用いて、 RNAi-1でもRNAi-2でもRNAi-3でもRNAi-4でも、ほぼ同じ結果が得られたので、 この結果はノックダウンによる効果である、と考察するのが多いですが。 （レスキュー実験までやると、さらに結果の信頼性が高くなる）

(無題) 削除/引用 No.183-4 - 2012/02/20 (月) 22:24:34 - AP 導入したdsRNAがリアルタイムPCRの鋳型になるよう実験デザインになっていたりはしないのですよね。

(無題) 削除/引用 No.183-3 - 2012/02/20 (月) 21:39:27 - あああ Harmonia　様 返信ありがとうございます。 > 発現はホントウに上昇したのでしょうか？ 現在、遺伝子レベルでは、リアルタイムPCRでの定量解析を行いましたので、 間違いないと思います。 > 別の手法でも上昇は確認できていますか？ とりあえず、遺伝子レベルでノックダウン効果を見る…という実験だったので、 タンパクの実験（ウエスタン等）は行っておりません。 > 発現抑制のポジティブコントロールは何ですか？ > ポジティブコントロール無しでは、効くはずなのに効かなかったのか、効かないことが当たり前なのか、判別できません。 発現抑制＝ノックダウンを必ずできる実験系があるかどうか、と考えてよろしいでしょうか？ そうならば、ノックダウンが効くかどうかを検討する実験ですので、 ポジコンはありません。 （なので、ノックダウンが出来ているかどうかを確認するために、 比較対照：ノントリートメント区およびGFPのdsRNA接種区を用意し、これらよりも遺伝子レベルで発現が有意に落ちたら、ノックダウン効果があったとみなします。） 遺伝子レベルでノックダウンが確認できれば、抗体を特注し、タンパクの実験に移る予定です。 > 上記を考慮した上でなお発現が上昇しているなら、議論できます。

(無題) 削除/引用 No.183-2 - 2012/02/20 (月) 21:17:00 - Harmonia 発現はホントウに上昇したのでしょうか？ 別の手法でも上昇は確認できていますか？ 発現抑制のポジティブコントロールは何ですか？ ポジティブコントロール無しでは、効くはずなのに効かなかったのか、効かないことが当たり前なのか、判別できません。 上記を考慮した上でなお発現が上昇しているなら、議論できます。

ノックダウンによる、発現の上昇 削除/引用 No.183-1 - 2012/02/20 (月) 19:58:35 - あああ 先日、ある遺伝子の、2本鎖RNA接種によるノックダウンを行いました。 リアルタイムPCRによって、ノックダウンの効果を確認をしたのですが、コントロール区（ノントリートメント区や2本鎖RNA GFP接種区）よりも、ノックダウンのターゲット遺伝子の発現量が有意に増加するという結果になりました。 （取り扱っている生物では、通常この方法でのノックダウンが可能、つまり、ノックダウンのターゲット遺伝子の発現量が有意に減少します。） 原因を考えているのですが、見当がつきません。 こういった現象の理由・原因をご存じの方がいらっしゃれば、教えてください。 宜しくお願いします。

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