> 一般的にこのような場合はネガコンとしてIgGやIgG2bを置かなくてもいいということでしょうか？
> 以前同様に蛍光染色である蛋白Bの発現を確認するのに@Rabbit IgG monoclonal抗B抗体ARabbit IgG B２次抗体のみで実験を行いましたが、
> @とBでは@の蛍光が特異的なものに見えましたが、@とAを比較すると差がなく非特異的なものと結論づけてしまいました。
> @とBだけでいいとすると発現が確認されたことになり自分としてはうれしい結果なんですが。
そういう経験があるのですね。
ブロッキングはBSAでしょうか、それとも標準血清でしょうか。
もしFcRを発現している細胞であれば、血清を使うか追加でFc Blockを使うことも考慮した方がよいかもしれません。
私の経験では、IgGのみでシグナルが見えたことはないので必要ないと感じていますが、細胞によりけりでしょうね。
他の経験として、フローサイトでの話ですが、(1) 抗体なし、(2) 二次抗体のみ、(3) isotype control + 二次抗体、(4) 一次抗体 + 二次抗体で比較したときに、(1)-(3)は全くピークが変わらず、(4)でかなりシフトする抗体があります。この抗体を用いて、目的タンパク質のノックアウト細胞（ホモ）、あるいは発現していないと判断された細胞（RT-PCR、Western Blotting）を染色すると、真ん中か少し高いくらいにピークがシフトしていました。
同じ経験を数種類の抗体で経験しています。
これは抗体の非特異的な吸着ではなく、非特異的な（あいまいな）認識によるものであって、isotype controlを用いてもわかりません。
そういう意味で、一次抗体のコントロールとしては発現していない細胞を用いる事がベストだと思いますが、whole IgGでも何もしないよりはよいと思います。
あとは、Western Blottingでシングルバンドになることを確認しておいた方が無難です。 |
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