Harmoniaさん
ありがとうございます。
私も、最初そのように考えていたのですが、いろいろ不安になって。
KEIOコレクションの方法は、Red/ET法を使っているようです。
One-Step法とも言うみたいです。
使用している論文が多いのですが、値段が…。
一応、駄目もとでWannerというオリジナル論文の著者に供与はお願いしてみるつもりです。
今回じゃなくてもあれば、すごく便利そうなシステムのようなので。
ターゲットベクターを作る際には、ターゲット配列の両端に制限酵素サイトを仕込み、直鎖で切り出せるようにして作れば、あとで環状にもできますし。
時間ももったいないので、後で最悪Red/ET法を使うことになっても、配列くらいは役立つものと考えてベクターを作成することにしました。
ベクター側の大腸菌複製起点を破壊すれば良いとも思ったのですが、そうするとプラスミドが取れない・・・とか?
複製起点のあるベクターに、ターゲット配列が組み変わってきても意味ないんじゃないかとか?プロモーター配列も不明なターゲットなので、プロモーターごと組み変わったら変なことになるんじゃとか???いろいろ考えてしまいました。
以前、違う菌種の組み換えをした際は、大腸菌の複製起点の有無とか気にしなかったですが
ありがとうございました。 |
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