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大腸菌ゲノムの改変 トピック削除
No.1932-TOPIC - 2013/05/11 (土) 02:06:44 - SN
大腸菌のゲノム改変を行う予定です。

自然界由来の大腸菌ゲノムを組み換え(大腸菌ゲノム内の遺伝子ノックアウト)を行う予定です。
ノックアウト遺伝子の両端外側の配列をアームにし中央にカナマイシンカセットを持たせたプラスミドベクター(pCR2.1ないしpBluescript SK)を作成し大腸菌に導入しようかと思ったのですが。
大腸菌に上手くベクターが導入され相同組み換えが起きたとしても、導入されたプラスミドベクターが大腸菌内にあると、発現しないとしても標的遺伝子の配列が大腸菌内に残ってしまうのではないか?
ないし、それこそタンパクとして発現してしまわないか?
加えて、ベクターにあるアンピシリン耐性遺伝子が大腸菌に残ってしまうのは、不都合な事情があります。

Red/ET recombination Kitとかを使えば、可能そうなのですが(参考論文は使用しています)、高価で…、使わずにできればと思います。

λファージ等のシステム出来るのではないかと思うのですが、手持ちのベクターもテクニックもなく、悩んでいます。

よろしくお願いします。
 
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(無題) 削除/引用
No.1932-4 - 2013/05/11 (土) 18:45:02 - SN
Harmoniaさん
ありがとうございます。

私も、最初そのように考えていたのですが、いろいろ不安になって。

KEIOコレクションの方法は、Red/ET法を使っているようです。
One-Step法とも言うみたいです。
使用している論文が多いのですが、値段が…。
一応、駄目もとでWannerというオリジナル論文の著者に供与はお願いしてみるつもりです。
今回じゃなくてもあれば、すごく便利そうなシステムのようなので。

ターゲットベクターを作る際には、ターゲット配列の両端に制限酵素サイトを仕込み、直鎖で切り出せるようにして作れば、あとで環状にもできますし。
時間ももったいないので、後で最悪Red/ET法を使うことになっても、配列くらいは役立つものと考えてベクターを作成することにしました。

ベクター側の大腸菌複製起点を破壊すれば良いとも思ったのですが、そうするとプラスミドが取れない・・・とか?
複製起点のあるベクターに、ターゲット配列が組み変わってきても意味ないんじゃないかとか?プロモーター配列も不明なターゲットなので、プロモーターごと組み変わったら変なことになるんじゃとか???いろいろ考えてしまいました。

以前、違う菌種の組み換えをした際は、大腸菌の複製起点の有無とか気にしなかったですが

ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.1932-3 - 2013/05/11 (土) 14:22:10 - maru
大腸菌の遺伝子破壊法の総説を一読すべきです。

(無題) 削除/引用
No.1932-2 - 2013/05/11 (土) 09:22:13 - Harmonia
カナマイシンで生えて、アンピシリンで生えないコロニーを単離する。
そのあと、残っては困る配列を標的にPCRで確かめる。

初期段階として、以上を提案します。

Keioコレクションは参考になると思います。
http://www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/strain/nbrp/explanation/keioCollection.jsp

大腸菌ゲノムの改変 削除/引用
No.1932-1 - 2013/05/11 (土) 02:06:44 - SN
大腸菌のゲノム改変を行う予定です。

自然界由来の大腸菌ゲノムを組み換え(大腸菌ゲノム内の遺伝子ノックアウト)を行う予定です。
ノックアウト遺伝子の両端外側の配列をアームにし中央にカナマイシンカセットを持たせたプラスミドベクター(pCR2.1ないしpBluescript SK)を作成し大腸菌に導入しようかと思ったのですが。
大腸菌に上手くベクターが導入され相同組み換えが起きたとしても、導入されたプラスミドベクターが大腸菌内にあると、発現しないとしても標的遺伝子の配列が大腸菌内に残ってしまうのではないか?
ないし、それこそタンパクとして発現してしまわないか?
加えて、ベクターにあるアンピシリン耐性遺伝子が大腸菌に残ってしまうのは、不都合な事情があります。

Red/ET recombination Kitとかを使えば、可能そうなのですが(参考論文は使用しています)、高価で…、使わずにできればと思います。

λファージ等のシステム出来るのではないかと思うのですが、手持ちのベクターもテクニックもなく、悩んでいます。

よろしくお願いします。

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