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(無題) 削除/引用 No.197-16 - 2012/02/29 (水) 09:01:02 - 組織 >[Re:15] Harmoniaさんは書きました : > ロールを水浴上でシートに伸ばすことができるなら、１枚目３枚目５枚目と２枚目４枚目６枚目をそれそれ別のスライドグラスに移すことはできないんでしょうか？ 可能だと思いますし、複数のペアの連続切片を集めておくのは効率的でしょうね。 > ミラーに関しては、１枚目の表と２枚目の裏って、厳密に言う必要はありますか？ 切片が十分薄くて、細胞密度が低い組織なら、あまり変わらないかもしれません。 ターゲット細胞の大きさや、組織配列によってミラーが有効です。 ちなみに、2umの切片を切るのは不可能だと思います。ミクロトームの設定はあくまで目安ですので、たとえ2umに設定したとしても、実際は5-6umくらいで切れてるはずです。最近はこのことを知らない学生さんが増えてきましたので、念のため。

(無題) 削除/引用 No.197-15 - 2012/02/24 (金) 22:37:19 - Harmonia やったことが無いので、想像だけで言います。 できるかどうかもわかりませんが、理論的には何とかなるので。 ロールを水浴上でシートに伸ばすことができるなら、１枚目３枚目５枚目と２枚目４枚目６枚目をそれそれ別のスライドグラスに移すことはできないんでしょうか？根性で。 ミラーに関しては、１枚目の表と２枚目の裏って、厳密に言う必要はありますか？2umがどいういう薄さ・厚さか、知識も経験もありませんが、ものすごい厳密さを求めないなら（甘い？）２枚目の表でも良いのでしょうか？ （トピ主さんのスレなので、ぼくへの反論は「ダメ」程度に短くしてください)

(無題) 削除/引用 No.197-14 - 2012/02/24 (金) 17:08:04 - てっぱん うさん 経験に基づく書き込み、ありがとうございます。 同じパラフィン切片の作成方法でも、人が変わると全く違っておもしろいですね。 必要のない情報かもしれませんが、当方では ジップロックに氷を入れてブロックを冷却、薄切、ガラスに貼り付け中に冷却、薄切の繰り返し 溶解パラフィンには長時間浸けない(トータル２時間を超えない) という感じです。 透徹剤は今までキシレンしか使用してこなかったので、安息香酸メチルを試してみたいと思います。 私見としてですが、どのような実験手技であろうと、聞いたままをそのまま使用できるとは考えておりません。各個人に合わせた再設定が必要であると考えております。従って、うさんのように経験的・感覚的な知識をいただけるのは非常にうれしく思います。 このまま続けるとスレ違いが酷くなりそうなので、一旦ここで終わりとさせていただきます。 購入が必要な試薬もあるので、すぐに結果は得られませんが、またこちらで報告いたします。 最後に、うさんをはじめ、返答いただいた皆様、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.197-13 - 2012/02/24 (金) 16:25:04 - てっぱん ＊さん リンクの提示、ありがとうございます。 沈着した色素を落とすという方法は頭にありませんでした。この方法が可能であれば切片も少数で済むのでいいですね。 色素と一緒に、目から鱗が落ちたようです。

(無題) 削除/引用 No.197-12 - 2012/02/24 (金) 14:44:17 - う これは、使用するパラフィンに依るところもあるかもしれませんが、 （どのメーカーかちょっと忘れました）私の経験です。 組織を包埋したパラフィンブロックを４℃の冷蔵庫で保管していました。 しかし、出してすぐ切るとあまりうまくいきませんでした。 また、冬寒い時もあまりうまくいきませんでした。 そういうときは、大腸菌を増やすときの３７℃のインキュベーターに しばらくブロックを入れておいて切片を作製していました。 イメージとしては、凍らせたチーズを包丁で切るのは難しいですが。 ちょっと温めて柔らかいチーズは容易であるといった感じです。 程よくあたたまっていることがいい感じです。 切る刃が超冷たいときも、室温にしてたりもしました。 透徹剤の話ですが、私の感覚、及び扱う組織に依るという前提ですが、 私の好みは安息香酸メチルです。 キシレンは組織が固く感じます。ガリっとした感じです。 あと、包埋の時、溶けたパラフィンに組織をつける時間は 結構長めにすることが多いです。下手すれば一晩とか。 これには根拠はあまり無いですが、馴染んだ方が切れやすい気がしてました。 感覚の話で失敬。

(無題) 削除/引用 No.197-11 - 2012/02/24 (金) 14:27:39 - 組織 > それぞれの一次抗体のホストが異なるのでHRP(DAB) と AP(vector red) の二重染色は検討いたしました。結果、どちらを先に発色させても２つ目の発色がうまくなされません。 > 細胞膜と細胞質のように発現部位の異なる発色の場合はうまくいっているので、生成した色素が他方の抗体をマスクしているのかと考えています。 > 今回のように局在が同じ細胞膜である場合、一段目の発色を弱くするなどの対策が必要なのでしょうか。個人的に濃いめの発色が好きものでして。 局在が重なっていると二重染色は難しいですね。私もうまくいったことがないです。

(無題) 削除/引用 No.197-10 - 2012/02/24 (金) 12:30:49 - てっぱん うさん、組織さん ありがとうございます。 それぞれの一次抗体のホストが異なるのでHRP(DAB) と AP(vector red) の二重染色は検討いたしました。結果、どちらを先に発色させても２つ目の発色がうまくなされません。 細胞膜と細胞質のように発現部位の異なる発色の場合はうまくいっているので、生成した色素が他方の抗体をマスクしているのかと考えています。 今回のように局在が同じ細胞膜である場合、一段目の発色を弱くするなどの対策が必要なのでしょうか。個人的に濃いめの発色が好きものでして。 後学のため、うさんのご意見をもう少し伺ってもよろしいでしょうか。 ちなみに私は古い人間なので、精神論で何とかなるのであれば幾らでも、です。 私は切片作成時、氷で冷やして切る派なのですが、温めるときはどのようにしていますか。 透徹剤で切り味が変わるとおっしゃっていますが、サンプルが柔らかく感じるような透徹剤はありますでしょうか。当方ではキシレンを使用していますがサンプルに堅さを感じることがありますもので。 もう少しのあいだ皆様のご意見を伺いたいものです。

(無題) 削除/引用 No.197-9 - 2012/02/24 (金) 12:08:16 - ＊ 以前に多様なトピックで紹介しましたが この中の再染色方が応用できるかもしれません http://www.fujita-hu.ac.jp/~kimigaai/handout/diagnostic_cytology_of_infectious_diseases_handout.pdf

(無題) 削除/引用 No.197-8 - 2012/02/24 (金) 11:12:13 - 組織 サンプルが小さいということでしたら、連続切片の方が無難でしょうね。 細胞密度が低い組織なら、同一細胞の見分けもそれほど難しくないでしょう。 あとは抗体がマウスとウサギに分かれていれば、HRP系とAP系を使い分けて発色法の二重染色も可能です。

(無題) 削除/引用 No.197-7 - 2012/02/24 (金) 10:09:56 - う これはあまり考えていないですが、 極端に色が異なる発色基質を使って２重染色とか。 あと、話はそれるかもしれませんが、切片作製について。 ここは少し改善の余地があるかもしれません。 単純に切る技術とか、組織を包埋するまでの処理とか。 前者でしたら、練習とそれだけでは何なんで２、３挙げると ブロックをちょっと（感覚なので何度とは言えませんが）温めて切るとか、 切片にはぁと息を吹きかけるとか（実際に霧吹きみたいな専用の品を見たことがある） 結構、練習や経験値の違いが反映されることもあります。 後者でしたら、個人的に透徹剤の変更で結構切れやすさが変わります。 もちろん免疫染色にも影響あるかもしれませんが。 例えば、安息香酸メチルにしたり、キシレンにしたり、レモゾールにしたり。 切片を切るというのは、分子生物学、キット全盛期の昨今でも 昔ながらの精神論（練習あるのみ）とか古くさい方法が 通用する部類かと思います。

(無題) 削除/引用 No.197-6 - 2012/02/24 (金) 09:40:50 - てっぱん Harmoniaさん、組織さん お二人もありがとうございます。 Harmoniaさんの案は連続切片で同一細胞を提示すること。 組織さんの案は同薄切面を提示すること。 になると思いますが、より強く同局在といえるのは、組織さんの案の方になりますでしょうか。 ただ当方のサンプル、設備そして私の技術の問題でミラー切片を得るのが難しいのです。下にかいつまんで書きますので、そこに関してもご意見いただければ幸いです。 滑走式ミクロトームを用いて、2um 厚の切片を切っています。 薄切の際シート状にならず、ロールされて回収されます。(伝わりますかね) ロールを水浴上でシートに伸ばし、ガラスに貼り付けています。 サンプル組織中の目的部位が20 um も無いので、これ以上厚く切るのは難しいのです。 上手にシート状に切る方法か、水浴上で伸ばした切片をひっくり返すかできればミラー切片にできるのですが。 重ね重ねの質問で申し訳ないですが、どうぞよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.197-5 - 2012/02/24 (金) 09:13:51 - てっぱん nonさん ありがとうございます。 教えていただいたキットは知らなかったので、試してみたいです。 ただすぐに動かせる金額ではないので、時期を見てになります。 試した際には使用感など書き込ませていただきます。

(無題) 削除/引用 No.197-4 - 2012/02/24 (金) 07:53:54 - 組織 パラフィンのミラー切片はどうでしょうか

(無題) 削除/引用 No.197-3 - 2012/02/23 (木) 21:06:27 - Harmonia 切片の１枚目と２枚目をそれぞれの検出をして、同じところが染まっていると主張する。

Duolink 削除/引用 No.197-2 - 2012/02/23 (木) 17:01:56 - mon 抗体の特異性は重要だけど、Duolinkという検出技術 kit があります。 http://www.nacalai.co.jp/products/recommend/olink3.html 使ったことがないので評価はできませんが、感度はよさそう。

共局在を示す方法について 削除/引用 No.197-1 - 2012/02/23 (木) 16:26:58 - てっぱん いつも参考にさせていただいています。 現在組織切片にて2つのタンパク質 (A, B) の局在を免疫染色で確認しています。 両タンパクの細胞内局在は同部位であることは確認しているのですが、同一細胞において同局在していることを示したいのです。良い案をお持ちの方は居りませんか。 現在までの状況は以下の通りです。 パラフィン切片　発色法：タンパク A, B ともに単独では ABC 法で HRP/ALP 染色が可能、HRP 標識二次抗体では検出不能。 パラフィン切片　蛍光法：タンパク A, B ともにバックグラウンドが高く検出不能 凍結切片　発色法：検討していません 凍結切片　蛍光法：タンパク A はパラフィン切片と同様の染色像が得られる。タンパク B はパラフィン切片に比べて非特異的な染色が認められる。タンパク B の非特異的な染色像は抗体希釈率やブロッキング剤の変更によって変化しない。 なお抗タンパク B 抗体の市販品は使用しているものだけです。 目的は切片上で共局在を示したいだけなので、どのような方法でもかまいません。 皆様のお知恵を拝借させて下さい。

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