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(無題) 削除/引用 No.1971-9 - 2013/05/15 (水) 07:16:24 - Panda おおさん くぁWせDRFTGYふじこLP；＠：「さん ありがとうございました。 IP可能な抗体であれば0.1％SDS程度なら機能するというのは、確かにその通りですね。ただ、SDS濃度を下げればIP効率が上昇しないかなぁ、と思った次第です。それにSDSは古くから使われているものですので、私が知らないだけで一般的な小分子を取り除く方法でなくSDSのみを特異的にかつ簡便に取り除く方法が実はあるのかな、と期待してました。 どうやらそうは問屋がおろさないと、楽な実験法ばかり探してはダメということですね。

(無題) 削除/引用 No.1971-8 - 2013/05/14 (火) 00:25:44 - おお いまおもいつきましたが、Triton x-114とか使えないだろうか、、、

(無題) 削除/引用 No.1971-7 - 2013/05/12 (日) 17:33:57 - くぁWせDRFTGYふじこLP；＠：「 SDSを除去するのは実際のところなかなか容易でないですが、SDSの変性作用を抑えるのは、比較的高濃度のNP40やTriton Xがよく使われます。最終濃度として少なくともSDS濃度の10倍くらいは必要と聞いています。抗体がIP可能でちゃんとしたものであれば、実際それくらいで多くの場合IPに成功しています。なのでたとえば１％SDSを含む試料ならば、容積比でその１０倍の液量かそれ以上の液量の、1%Triton X 100を含むbufferで希釈することになります。もちろんケースバイケースなので、ある程度条件をふってみる必要もあるでしょう。場合によってはSDS濃度が0.05%くらいになるようにもう少し希釈した方がいいかもしれません。 ひとつ問題として、希釈してSDS濃度を下げた時に溶けていた蛋白質が徐々に不溶化して沈殿してしまうことがありました。もともと難溶性でSDSでようやく可溶化できたような蛋白質の場合は注意が必要かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1971-6 - 2013/05/12 (日) 13:22:22 - おお electroelutionみたいな感じで、SDSだけ流してしまうのはどうかしら。 あと、たしかに沈殿させるとリカバリーが気になりますね。 IPを回避した面白いアプローチがとれないかなぁとか、、、

(無題) 削除/引用 No.1971-5 - 2013/05/12 (日) 13:03:51 - Panda >[Re:4] おおさんは書きました : > > > 高濃度SDSですでに変性しているのですが、、、 難溶性のペレットになって温和な条件で溶解できなくなるかも。って意味で書きました。変性はしてますね、もちろん。

(無題) 削除/引用 No.1971-4 - 2013/05/12 (日) 12:55:29 - おお >[Re:3] Pandaさんは書きました : > > タンパク質沈殿は変性が気になりますね。無難なところはゲルろ過ですかね。 高濃度SDSですでに変性しているのですが、、、

(無題) 削除/引用 No.1971-3 - 2013/05/12 (日) 12:31:44 - Panda RIPAバッファーのフルネームを初めて知りました。恥ずかしい限りです。 質問は具体的に言いますとお話にある様にChIPでございます。 ChIPではIPの時に最終濃度で0.1％SDSにします。しかし、これは0.1％が目的と言うよりも、Sonication時に1％SDS条件が必要なので、なんとかSDS濃度を下げようとした結果として10倍希釈の0.1％に行き着いていると考えます。これ以上希釈すると液量が多すぎて色々不便ですし、Sonication時のSDS濃度はクロマチンの断片化効率にクリティカルに作用します。 しかし、この0.1％SDSでIPという条件がよりマイルドな条件でIPができるのにChIPではシグナルが得られない抗体が多いことの一つの原因ではないでしょうか（あとはSDSによる目的蛋白質の変性でしょうか）。このポイントを解決できたら、DNAに直接結合しないCofactorのChIPがもっとやりやすくなるかもなぁ、思いまして考えております。 透析は時間かかりますし、タンパク質沈殿は変性が気になりますね。無難なところはゲルろ過ですかね。

(無題) 削除/引用 No.1971-2 - 2013/05/11 (土) 14:21:34 - おお 最近ユビキチンなどコバレントな結合をみたり、ChipアッセイなどでクロスリンクしたものをIPするのに、SDSで溶解しておき、TRITON deoxycholateのはいったバッファーで0.1%以下のSDS濃度にしてIPするという方法がけっこうやられるようになりました。RIPA bufferといわれるbufferはRadioimmunoprecipitation assay buffer のことですが、0.1%のSDSがほかの界面活性剤と一緒にはいっていて、IPにはワークするバッファーです(もちろん抗体との相性もありますが)。SDSを加えたあと薄めることによりRIPA bufferと同じような組成にしてIPができるようにするということです。 透析でも抜けると思いますし、目的によってはTCA沈殿とかアセトン沈殿、メタノールクロロフォルム沈殿などでもいいかもしれません。 塩濃度やpHでも沈殿するのでいいかもしれませんが、どの程度溶液中に残るのか、沈殿している際に蛋白を巻き込むのではとかいうところがよくわかりません。

細胞抽出液からのSDSの除去 削除/引用 No.1971-1 - 2013/05/11 (土) 13:20:35 - Panda 実験中にふと気になることが有りまして、トピックを立てさせてもらいました。 お時間の余裕があるときにでも答えて貰えれば幸いです。 現在、培養細胞からの細胞抽出液作製のため、1％SDSが入ったバッファーを使用しています。この条件は諸事情あって変えられないのですが、1％のSDS濃度はダウンストリームの実験（主にIPです）に不向きでなんとかSDSを細胞破砕後に取り除けないものかと考えておりました。 そこでふと、ミニプレップの時のようにカリウム等でSDSを析出させて、遠心で分離できないものか、との考えが浮かびました。 探せばなんか近しいプロトコールが見つかりそうな気がして、ざっと検索してみましたら、SDS-Out SDS Precipitation KitなるものをThermoで見つけました。しかし、どうせ塩しか入ってないんじゃないかと思うとちょっと高いです。 そこで、自分で実験して検討しろと言われそうですが、SDS除去のためにオススメの塩と濃度等ご存じの方がいらっしゃいましたらお教えください。 また、別の方法でSDSの除去を行なっている方（キットを使わずに）もいらっしゃいましたら情報をいただけたら幸いです。

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