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(無題) 削除/引用 No.1999-14 - 2013/05/16 (木) 22:09:29 - クローン MP様 ご返答いただき、ありがとうございます。 Addgeneは事務手続きが厄介そうで今まで利用してこなかったのですが、利用経験ある方がいらっしゃましたら、お話をお聞かせ願えますと幸いです。 ウイルスは設備や初期費用の問題があるので、今の系がどうしても上手くいかなかった時に考えたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1999-13 - 2013/05/16 (木) 18:44:09 - MP Addgeneをざっと見たところpEF IRES Neoなんかありますね。 ここから購入したことはないので、実際どのくらいかかるのかわかりませんが、少なくとも業者よりは安いでしょう。 それから、安定発現細胞株をとるには、やはりウイルスを使った方が効率がいいと思います。 レトロだとpMXシリーズは頼めば供与していただけますし（少なくとも１０年前は）、レンチだったら理研から安く手に入ります。

(無題) 削除/引用 No.1999-12 - 2013/05/16 (木) 18:01:15 - クローン MP様 ご返答いただき、ありがとうございます。 3種類発現ベクターを作成していますが、すべて薬剤耐性遺伝子は別のプロモーターになります。他の細胞株では発現するのでtoxicではないと思うのですが、血球細胞での報告はないため、場合によっては誘導系も考えなければならないかもしれません。IRES発現ベクターは安価に手に入ればよいのですが・・・ ~様 ご返答いただき、ありがとうございます。 薬剤なし親株のみでの検討をすっかり忘れていました・・・コロニーの成長度合いや96 wellへ移行後の生存割合が今より改善された場合、その可能性が高いと考えられますので、早速やってみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1999-11 - 2013/05/16 (木) 10:13:27 - ~ そういえば、今やられているメチルセルロース培地→96ウェルプレートのシングルクローン取得法は、HL60親株のセレクションなし条件ではできるのでしょうか？ できるのであれば、使用しているG418の濃度が高密度培養条件用で、 薄撒き条件だと濃すぎるということもあるのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1999-10 - 2013/05/15 (水) 18:58:17 - MP ちょっと気になったのですが、薬剤耐性遺伝子はIRESにつないであるのでしょうか？それとも別のプロモーターでドライブされるタイプでしょうか？IRESだと、その遺伝子産物がToxicでない限りはバルクでも大抵の場合は安定発現細胞株がとれます。クローニングの作業は結構大変ですよね・・・。

(無題) 削除/引用 No.1999-9 - 2013/05/14 (火) 19:09:00 - クローン ~様 ご返答いただき、ありがとうございます。 貼っていただいた論文がコロニーアッセイで引用した文献を見ました。 12 well plateで20% FBS, 500cells/ wellの条件で蒔いているみたいですが、メチルセルロースでもコロニーアッセイの場合は10cmシャーレに5000-10000cells蒔いているものを見たことがあります。 単一細胞化する場合も同じくらい蒔いて大丈夫なのか、検討項目の一つに入れてみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1999-8 - 2013/05/14 (火) 16:14:05 - ~ 私が軟寒天培地で扱っていたのはもっと適当な条件で増える細胞だったので、HL60だと勝手が違いそうです。 17日だと数千細胞かそれ以上あるものだと思っていました。 逆に、そんなに長期間37度においていたら培地が痛みませんかね。 http://www.springerimages.com/Images/LifeSciences/1-10.1007_978-1-61779-273-1_19-3 のFig. 4だとuntreatedで12日で染色して見えるくらいのコロニーがあるようですね。

(無題) 削除/引用 No.1999-7 - 2013/05/14 (火) 12:45:22 - クローン おお様 ご返答いただき、ありがとうございます。 共培養からセレクションは考えてもみませんでした。 一度チャレンジしたいと思います。 ~様 ご返答いただき、ありがとうございます。 ピックアップしたものは特に遠心、洗浄などのステップは入れず、96 wellにそのまま移しただけの状態でした。過増殖による内部環境の悪化ですが、もう少し早い段階で移した方がよいのでしょうか？確かに添付文書には細胞にもよるが10-14日後にピックアップと書いてあります。鏡検では17日目で10個未満の細胞からなるコロニーも多くみられ肉眼で見えるようになってから移すというプロトコルもあることから、もう少し育ててからの方がよいかなと思ったのですが、、、

(無題) 削除/引用 No.1999-6 - 2013/05/14 (火) 09:58:56 - ~ 軟寒天培地やメチルセルロース培地でHL60細胞を扱ったことがありませんが、 限界希釈法は難しいですね。 薄撒きにも遠心にも弱いので、あまり好みではない細胞です。 昔予備検討を行ったときは、96 wellプレートで1 wellあたり10個位のHL60細胞を撒いたら生えて、1個では生えませんでした。 ただ、その際は特にコンディションドメディウムは使っていませんでした。 そのため、 >17日間培養後、鏡検下シングルコロニーを30コロニーほどピックアップしましたが、その内96 well plateで生育したのは1コロニーだけでした の部分に違和感を感じます。 それだけ増殖させれば細胞数は十分多いと思いますので、死ぬ原因は薄撒きではないと思います。 増殖しすぎて内部の細胞が死んでいて、それを持ち込んだために培養環境が悪化したりしていませんかね。 または、ピックアップ後に遠心による洗浄のステップを入れていて、遠心のダメージでダメになっていませんかね。

(無題) 削除/引用 No.1999-5 - 2013/05/14 (火) 08:37:11 - おお >リミッティング・ダイリューションのことでしょうか？ そうなんですが、ちょっと思いついたので、、、 96ウェルシングルセルになるようにまいて、そこに遺伝子が導入されてない細胞を巻き込み共培養して(１日ほどセレクションマーカーなしで)、その後マーカーを加えるとかどうかなあと思いました。96ウェルで細胞がおおくなりすきるようだと、きょう培養のあと48とか24ウェルにまきなおしてからマーカー加えるとか。きょう培養しててもマーカー耐性遺伝子がない細胞はのぞけますよね。

(無題) 削除/引用 No.1999-4 - 2013/05/14 (火) 00:26:45 - クローン おお様 ご返答ありがとうございます。 HL-60は薄蒔きに弱いため、10cmシャーレに大体細胞100個〜1000個になるよう何段階か条件をふってメチルセルロース培地に混和、蒔いたものから出現したコロニーをピックアップして96 wellに移していました。 "96wellなどでシングルセルを植える"とはリミッティング・ダイリューションのことでしょうか？リミッティング・ダイリューションも行いましたが、細胞が生えてこずメチルセルロースへと手法を変更したのですが、conditioned mediumでは試していなかったので、選択肢の一つい入れたいと思います。 現在はG418でセレクションがかかったものから単一細胞化を試みていますが（系の確立のため）、のちのちはトランスフェクションしたものを直接セレクションと同時に単一細胞化し安定発現株を得ることを考えています。

(無題) 削除/引用 No.1999-3 - 2013/05/13 (月) 22:34:04 - おお 96wellなどでシングルセルを植えるというてもとれますよね。いずれにせよconditioned mediumを使うといい場合がありますね。 ちょっと確認ですがG418でセレクションかけてから、単一細胞をばいようしているのですよね、、、

(無題) 削除/引用 No.1999-2 - 2013/05/13 (月) 22:29:25 - おお あがろーす(軟寒天)を用いた場合はゲル上の培地のうえに、液体培地を重層すると思いましたが、、、メチルセルロースではしないんでしょうかね。。。まざってくるのかな。。。

浮遊系細胞の安定過剰発現株の樹立 削除/引用 No.1999-1 - 2013/05/13 (月) 22:12:32 - クローン 現在HL-60を用いて安定過剰発現株の樹立を試みています。 エレクトロポレーションで導入しG418で薬剤選択した後、目的のタンパクの発現を確認しましたが、バルクの状態ではほとんど増加が認められませんでした。 そこでメチルセルロース（Stemcell社のClonaCell FLEX）による単一細胞化を試み、17日間培養後、鏡検下シングルコロニーを30コロニーほどピックアップしましたが、その内96 well plateで生育したのは1コロニーだけでした（血清20%で使用）。 当方、メチルセルロース培養は初心者であり、いくつか質問させていただきたいのですが（以下、箇条書きにします）、 1.コロニーが目視できるまで生育させてから、ピックアップした方が無難に思いますが、どのくらいの期間かかるものなのでしょうか（逆にどのくらいの期間目視できる細胞が現れなかったら勝算が低いと考えられるでしょうか）？また、目視できる細胞数はどのくらいからなのでしょうか（もちろん細胞の大きさにもよりますが）？ 2. メチルセルロース培養中、何度か鏡検していたこともあり、25日目くらいで培地が乾燥してしまいました。特に出し入れの際の消耗が激しいように思うのですが、培地が乾かない工夫として、よいものがありましたら教えていただけますと幸いです。 3. その他、アドバイス等（他の方法も含め）いただけたら幸いです。 よろしくお願いいたします。

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