Bio Technical フォーラム

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ATP assay のサンプリング方法について トピック削除
No.2001-TOPIC - 2013/05/16 (木) 01:39:40 - ak
いつも大変お世話になっております。

基本的なことですが、皆様の知恵をお貸しください。

私は24well プレートにまいたNIH3T3細胞において、ATP assayによりその細胞生存率を測定しております。
しかしながらwellからのサンプリングの際、細胞をすべてとりきることができずに(サンプリング後のdishを見てみると、wellの底に接着した細胞が残っているように見える)結果として、測定値がばらついてしまいます。
どのようにすれば正確にサンプリングすることができるでしょうか。

私が行っているプロトコールは以下の通りです。

150μL/wellのATP assay solusionをウェルにそそぐ。

遮光下で10分間振盪

ピペッティングにより細胞をはがす(各ウェルについて激しく1分間ピペッティング)

100μLを別の白色96wellプレートに移す

蛍光を測定


以上です。

どうかよろしくお願いします。
 
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(無題) 削除/引用
No.2001-4 - 2013/05/16 (木) 12:37:09 - ak

おお 様

早速のコメントありがとうございます。
私はPromegaのCellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assayを使って、ルシフェラーゼ発光をプレートリーダーで測定しています。
説明が十分でなく、すみませんでした。

(無題) 削除/引用
No.2001-2 - 2013/05/16 (木) 03:49:30 - おお
蛍光でなくって、ルシフェラーゼの発光を見ているのではないですか?

キットがどのようにATPを抽出して測定するものかよく分かりませんので、もし差し支えなければお使いのキットの商品名を提示してみてはどうでしょうか。

細胞からATPを抽出するのなら、細胞のでぶりは必要ないですよね。ATPは2.5%ぐらいのTCAや90%のアルコール、DMSOでも抽出できます。どのような溶媒で抽出して、どのようにすれば下流の反応に影響なく測定できるかは、キットの内容がないとなんともいえません。

もし、2ー3倍に薄めても検出限界に至らないのであれば、バッファーを増やせばいいだけのことかもしれませんよ。

ATP assay のサンプリング方法について 削除/引用
No.2001-1 - 2013/05/16 (木) 01:39:40 - ak
いつも大変お世話になっております。

基本的なことですが、皆様の知恵をお貸しください。

私は24well プレートにまいたNIH3T3細胞において、ATP assayによりその細胞生存率を測定しております。
しかしながらwellからのサンプリングの際、細胞をすべてとりきることができずに(サンプリング後のdishを見てみると、wellの底に接着した細胞が残っているように見える)結果として、測定値がばらついてしまいます。
どのようにすれば正確にサンプリングすることができるでしょうか。

私が行っているプロトコールは以下の通りです。

150μL/wellのATP assay solusionをウェルにそそぐ。

遮光下で10分間振盪

ピペッティングにより細胞をはがす(各ウェルについて激しく1分間ピペッティング)

100μLを別の白色96wellプレートに移す

蛍光を測定


以上です。

どうかよろしくお願いします。

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