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(無題) 削除/引用 No.2003-14 - 2013/05/19 (日) 21:44:16 - AA NEBが制限酵素について基礎知識の冊子を配っていたと思います。 出入りの業者に頼んで1冊取り寄せてもらってはいかがでしょうか？ 認識配列一覧からStar活性、失活温度、断端からの塩基数による活性の違いなどなど、色々載ってて勉強になります。

(無題) 削除/引用 No.2003-13 - 2013/05/18 (土) 16:12:39 - おお >[Re:12] QKさんは書きました : > primerに制限酵素サイト付けてとか、初心者に言っても混乱させるだけなんじゃないかなぁ。 > > 制限酵素の認識を良くするために、余分に２〜４塩基付けたりする必要があるとか気づかないし、また混乱するだけなんじゃないかなぁ。 > > そこまで面倒見きれないんだなぁ。 いやーそれも気がつかないひとって初心者っていうより、、、やる気ない人とか、そういった類の人だと思ったり、、、

(無題) 削除/引用 No.2003-12 - 2013/05/18 (土) 16:00:58 - QK primerに制限酵素サイト付けてとか、初心者に言っても混乱させるだけなんじゃないかなぁ。 制限酵素の認識を良くするために、余分に２〜４塩基付けたりする必要があるとか気づかないし、また混乱するだけなんじゃないかなぁ。 そこまで面倒見きれないんだなぁ。

(無題) 削除/引用 No.2003-11 - 2013/05/18 (土) 15:34:41 - Q ＞すみません。私も、なんとなく5'末端がコザック配列で終ってしまうプライマーはうまくPCRがかからない気がしてしまっただけで、詳しい理由はないのです。 なんとなく、どうでもいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2003-10 - 2013/05/17 (金) 23:58:50 - おお >[Re:7] 研究初心者さんは書きました : > ＞おおさん > > 何の意味があるか…正直なところそれは自分でもわかっていません。プライマーの5'末端がコザック配列で終ってしまうのはなんとなく問題あるような気がしただけなんです。 なんとなくでなくて、具体的に追求できなければ、研究はできませんよ。 そもそもそこでおわっていても、プラスみどにいれたら上流につながっているじゃないですか。

(無題) 削除/引用 No.2003-9 - 2013/05/17 (金) 23:24:37 - 独り言 > ＞独り言さん > > Tペクターの制限酵素サイトを利用しようと考えていました。 > ターゲット配列以外の5'側につける制限酵素配列およびその足場数merはTm値の計算には含めなくていいのでしょうか？もしそうならば、まず付加相列を付ける前のターゲット配列部分だけのTm値を計算して、そのTm値を参考にPCRをかければよろしいのでしょうか？ > はいそうです。 TAクローニングしてから、目的ベクターに組み直すのは面倒だから、プライマーに制限酵素つけて、いきなり最終目的ベクターに入れた方が楽なんだなぁ。 プライマーの５末端に相補的でない配列があっても問題なし。もちろん、そのぶん非特異的PCRが増える可能性があるだけ。テンプレートがプラスミドならまったく気にしない。テンプレートがトータルcDNAとかなら、非特異が増える場合はある。とありあえず、相補サイト20bp+酵素サイト6bp+適当な4bp=30bpでやってみるとよろし。

(無題) 削除/引用 No.2003-8 - 2013/05/17 (金) 22:58:59 - おお >[Re:7] 研究初心者さんは書きました : > ＞独り言さん > > Tペクターの制限酵素サイトを利用しようと考えていました。 片側ブラントでもいいんじゃない?

ご回答ありがとうございます。 削除/引用 No.2003-7 - 2013/05/17 (金) 20:33:18 - 研究初心者 ＞おおさん 何の意味があるか…正直なところそれは自分でもわかっていません。プライマーの5'末端がコザック配列で終ってしまうのはなんとなく問題あるような気がしただけなんです。 ＞独り言さん Tペクターの制限酵素サイトを利用しようと考えていました。 ターゲット配列以外の5'側につける制限酵素配列およびその足場数merはTm値の計算には含めなくていいのでしょうか？もしそうならば、まず付加相列を付ける前のターゲット配列部分だけのTm値を計算して、そのTm値を参考にPCRをかければよろしいのでしょうか？ ＞tttさん 私のラボには、３流大故か少々分野が違う故かプライマー設計等に詳しい指導者がいないのです。生理的発現というのは、CDSに含まれないmRNAの部分にも大事な配列があるかもしれないという解釈でよろしいのでしょうか？ ＞Qさん すみません。私も、なんとなく5'末端がコザック配列で終ってしまうプライマーはうまくPCRがかからない気がしてしまっただけで、詳しい理由はないのです。 ＞モモさん はい。Tベクターに入れてから、発現ベクターに移し替えます。

(無題) 削除/引用 No.2003-6 - 2013/05/17 (金) 20:13:13 - モモ プライマーに制限酵素サイトを入れるならその前にさらに何個か入れますけど、制限酵素サイトを使わないならいらないんじゃないですか？ 一度Tベクターかなんかに入れて、そのベクターのサイトを使うつもりなんですよね？

(無題) 削除/引用 No.2003-5 - 2013/05/17 (金) 13:08:42 - Q >この場合、Kozak配列の前には何もつけなくていいのでしょうか？数merつけた方が良いのでしょうか？ そう思う理由がわからないことには、コメントしようがない気がするのは 私だけでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2003-4 - 2013/05/17 (金) 00:22:04 - ttt TA cloningとかblunt endのTOPO cloningで一旦クローニングベクターに入れるなら末端は気にする必要ないかも知れませんね。 上流配列も、生理的な発現はどうでもよくて、CMVプロモーターでとにかくガンガン発現してくれさえすれば良いというのであればコザック配列だけで良いかと。その辺は実験の目的によるので、指導者の人に聞くのが良いかと思われます。

(無題) 削除/引用 No.2003-3 - 2013/05/16 (木) 23:54:32 - 独り言 > Kozac配列の前に制限酵素を入れる事も考えましたが、Tm値が高くなってしまうということもあり、クローニングベクターのMCSを利用する事もできるためとりあえずこれで考えてみました。 > プライマーに制限酵素をつけずに、どうやって、ベクターに組み込むのかなぁ？ プライマーの５末端にエキストラな制限酵素サイトを付加する場合は、その部位のTm値を気にする必要はないはずなんだなぁ。

(無題) 削除/引用 No.2003-2 - 2013/05/16 (木) 21:39:43 - おお 数merつけることに何の意味があるのでしょうか。発現ベクターのtranscription start siteはそれより上流になるはずです。少なくともコザックより数mer以上上流でしょう。 わたしなら、ATGの上流もエンドの配列をつかいます。なぜらな、その配列が実際の細胞で発現するのに有効でワークしているからです。

プライマー設計におけるKozak配列について 削除/引用 No.2003-1 - 2013/05/16 (木) 18:55:17 - 研究初心者 はじめて質問させていただきます。 よろしくお願いします。 現在、マウスの細胞にある蛋白を強制発現させる為に、発現ベクターの構築をしています。 そこでインサートを作る為のプライマー設計についてなのですが、 センスプライマーを Kozak配列ーATGー標的配列といったふうに設計してみました。 Kozac配列の前に制限酵素を入れる事も考えましたが、Tm値が高くなってしまうということもあり、クローニングベクターのMCSを利用する事もできるためとりあえずこれで考えてみました。 この場合、Kozak配列の前には何もつけなくていいのでしょうか？数merつけた方が良いのでしょうか？ わかりにくい文章で申し訳ありませんが、ご教授お願いいたします。

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