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マウスBMDCの培養実験について トピック削除
No.2004-TOPIC - 2013/05/16 (木) 22:05:49 - BMDC
現在マウスのBMDCを用いた実験を行っています。

BMDCの培養は、マウス骨髄細胞浮遊液を作製し、RBCを溶血後、10ng/mLのrmGM-CS入りRPMI(10%FBS+50uMβ-ME)で2日間培養後(2x10^6個/2mL/well 12well plate)全ての培地を一回除去しています。その後、2日おきに新しい10ng/mL rmGM-CSF入りMediumを用いてMedium changeを行い、6日目に浮遊している細胞及び弱付着系細胞を採取しています。その細胞を新しい10ng/mL rmGM-CSF入りMediumに再懸濁し、一晩ペトリディッシュで培養します。次の日に付着していない細胞を回収し、MACSを用いてCD11c+細胞をポジティブセレクションにて採取してきました。

その細胞を用いて各種刺激物質による刺激実験を行っています。
細胞密度は、5x10^5cells/500uL/well (24well plate)です。
刺激(たとえばLPS)したもの及びControlで3時間後観察するとマイクロプレートに付着してしまっています。(GM-CSFは添加しています)

BMDCは刺激した場合、及び刺激しない場合でもマイクロプレートに付着してしまうのでしょうか?

BMDCの刺激実験を行う場合は、マイクロプレートはnon-treatmentのものを用いないといけないのでしょうか?(こちらを用いても付着しています)

どうぞ教えて下さい。
 
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(無題) 削除/引用
No.2004-4 - 2013/05/18 (土) 02:28:08 - あ
この人は自分の実験結果を信じられないのでしょうか。

トリプシン処理してFACSはうまくいくのですかね。。。

(無題) 削除/引用
No.2004-3 - 2013/05/17 (金) 21:50:05 - BMDC
月詠様

早速のご返信ありがとうございます。
実験に使用するマイクロプレートはいかがでしょうか?
ノントリートのものを使用していますか? それとも通常のものでしょうか?

論文等ではその後FCM解析しているものも多々あると思いますが、その場合は付着したものをトリプシンEDTAではがしてからおこなっているのでしょうか?

追加で申し訳ありませんが、ご存知でしたら教えて下さい。

(無題) 削除/引用
No.2004-2 - 2013/05/17 (金) 02:04:57 - 月詠
プロトコールはほぼ定法とおりですので特に問題ないと思います。

骨髄幹細胞から分化誘導した未熟樹状細胞は貪食能は旺盛ですが付着性が弱く洗浄で剥がれてきますけど、刺激(特にLPS等の微生物由来分子)によって成熟化するとMHC classII分子や共刺激分子(CD86等)だけでなく接着因子等の発現も上昇するので培養皿への付着性が増加するのも問題ないように思います。

マウスBMDCの培養実験について 削除/引用
No.2004-1 - 2013/05/16 (木) 22:05:49 - BMDC
現在マウスのBMDCを用いた実験を行っています。

BMDCの培養は、マウス骨髄細胞浮遊液を作製し、RBCを溶血後、10ng/mLのrmGM-CS入りRPMI(10%FBS+50uMβ-ME)で2日間培養後(2x10^6個/2mL/well 12well plate)全ての培地を一回除去しています。その後、2日おきに新しい10ng/mL rmGM-CSF入りMediumを用いてMedium changeを行い、6日目に浮遊している細胞及び弱付着系細胞を採取しています。その細胞を新しい10ng/mL rmGM-CSF入りMediumに再懸濁し、一晩ペトリディッシュで培養します。次の日に付着していない細胞を回収し、MACSを用いてCD11c+細胞をポジティブセレクションにて採取してきました。

その細胞を用いて各種刺激物質による刺激実験を行っています。
細胞密度は、5x10^5cells/500uL/well (24well plate)です。
刺激(たとえばLPS)したもの及びControlで3時間後観察するとマイクロプレートに付着してしまっています。(GM-CSFは添加しています)

BMDCは刺激した場合、及び刺激しない場合でもマイクロプレートに付着してしまうのでしょうか?

BMDCの刺激実験を行う場合は、マイクロプレートはnon-treatmentのものを用いないといけないのでしょうか?(こちらを用いても付着しています)

どうぞ教えて下さい。

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