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in situ ハイブリダイゼーションのための凍結切片の作製 トピック削除
No.2005-TOPIC - 2013/05/17 (金) 09:03:19 - SH
組織切片 in situ ハイブリダイゼーションを行うため,凍結切片をのせたスライドを用意しています。
切片をのせた後の処理についてどなたかご教授願います。

組織を4%PFAで固定後,OCTコンパウンド中 -80度で凍結した試料をクライオスタットで切片にします。
この後の処理で,プロトコールによって(1)37度で一晩乾燥させる,(2)ドライヤーの冷風を当てて乾燥させる,(3)30分室温放置で乾燥させる,または(4)ただちに-80度で保存する,という違いがあるのですが,OCTコンパウンドを乾燥させたほうが良いのでしょうか。それとも室温以上ではRNA分解の恐れがあるため乾燥させずにただちに低温に移す必要があるのでしょうか。

どうぞよろしくお願い致します。
 
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(無題) 削除/引用
No.2005-9 - 2013/05/19 (日) 12:53:56 - SH
ご回答ありがとうございました。
大変参考になりました。

(無題) 削除/引用
No.2005-8 - 2013/05/18 (土) 10:31:55 - AA
・ドライヤー冷風で20分
・室温に一晩静置で乾燥
の2通りをやっていますが、(貼り付け方で使い分けています)
どちらの方法でもin situはうまくいっています。

マイクロダイセクションの講習会でLeicaの人が言っていましたが、
RNaseは乾燥している間は活性がかなり低いんで、無固定のものでも十分に乾燥していれば室温でもほとんど分解しないそうです。
データで見せてくれたわけではないですが、RNAを回収するのが目的のLMD講習会でそういうのですからきっとそういうデータも社内に持っているのだと思います。

冷凍庫から切片を出してきたときは、
結露を防ぐために箱を開ける前に室温に戻す、
スライドは迅速に選びすぐに4%PFA(in situの最初のステップ)へ進む、
を心がけています。

(無題) 削除/引用
No.2005-7 - 2013/05/17 (金) 15:18:03 - 組織
> スライドをハイブリ実験に使用する際にスライドボックスを-80度のフリーザーから出して室温に戻すという意味です。

私はこのステップを30分〜1時間の風乾でやってます。

(無題) 削除/引用
No.2005-6 - 2013/05/17 (金) 14:41:08 - SH
ご返答ありがとうございました。

「ハイブリ実験直前」という表現がわかりくく申し訳ありません。
スライドをハイブリ実験に使用する際にスライドボックスを-80度のフリーザーから出して室温に戻すという意味です。
あるプロトコールには「30分から一時間程度室温で乾燥させる」とあります。

(無題) 削除/引用
No.2005-5 - 2013/05/17 (金) 13:09:09 - 組織
風乾は切片の剥離防止です。もし不安なら、ドライヤーで急速乾燥すればいいでしょう。

既固定凍結切片であれば、固定しているので内因性のRNaseはあまり気にしなくてもいいかと思います。
未固定(新鮮)凍結切片でも、いつも30分〜1時間くらい風乾してますが、特に問題を感じたことはありません。

>ハイブリ実験直前にもスライドを室温で風乾させるステップがあると思うのですが。
どういう操作でしょうか?多分必須ではなさそうですが。

(無題) 削除/引用
No.2005-4 - 2013/05/17 (金) 11:08:59 - SH
組織 様

早速のご回答ありがとうございます。

初歩的な質問で恐縮ですが,乾燥(風乾)の目的はin situ ハイブリ実験での切片の剥がれを防止するためなのでしょうか。RNaseの働きを阻止するためでしょうか。その両方でしょうか。

ラボで,「組織を貼ったスライドを室温で30分放置するとRNAが分解する。」という指摘を受けたのでこの部分の乾燥処理が大変気になります。
ハイブリ実験直前にもスライドを室温で風乾させるステップがあると思うのですが。

重ねて質問させていただきましたが,よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用
No.2005-3 - 2013/05/17 (金) 09:51:02 - 組織
ドライヤーは温風5秒の後、冷風20〜30秒でやってます。

(無題) 削除/引用
No.2005-2 - 2013/05/17 (金) 09:49:35 - 組織
私はドライヤーで速やかに乾燥させ、-80度で保存してます。使用時は、フリーザーから出して風乾30分です。

切片が濡れているとRNaseが働くかもしれないので、その点に注意すれば、どの方法でもいいんじゃないでしょうか。37度は避けた方がいいかもしれませんが。

in situ ハイブリダイゼーションのための凍結切片の作製 削除/引用
No.2005-1 - 2013/05/17 (金) 09:03:19 - SH
組織切片 in situ ハイブリダイゼーションを行うため,凍結切片をのせたスライドを用意しています。
切片をのせた後の処理についてどなたかご教授願います。

組織を4%PFAで固定後,OCTコンパウンド中 -80度で凍結した試料をクライオスタットで切片にします。
この後の処理で,プロトコールによって(1)37度で一晩乾燥させる,(2)ドライヤーの冷風を当てて乾燥させる,(3)30分室温放置で乾燥させる,または(4)ただちに-80度で保存する,という違いがあるのですが,OCTコンパウンドを乾燥させたほうが良いのでしょうか。それとも室温以上ではRNA分解の恐れがあるため乾燥させずにただちに低温に移す必要があるのでしょうか。

どうぞよろしくお願い致します。

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