Bio Technical フォーラム

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タグ付き発現ベクターを作る上で トピック削除
No.2009-TOPIC - 2013/05/18 (土) 07:00:55 - vector
よろしくお願いします。

現在すでに持っている遺伝子Aの発現ベクターを改変して、タグ付き発現ベクターを作成しようと思っています。この遺伝子Aでは5'側がcleveされることが分かっているので、タグは3'側につけます。

そこで、"ストップコドン直前までの遺伝子Aの3'末配列(20bp程度?)-タグ配列-stop codon(TGA)-制限酵素配列"に対するアンチセンスプライマーと、使いやすい制限酵素配列を含んだ遺伝子Aの末端から300bp程上流の配列に対するセンスプライマーとで、遺伝子A発現ベクターをテンプレートとしてPCRをかけ、制限酵素配列を利用して、できた産物を遺伝子A発現ベクターに組み込もうと思っています。

ここで質問なのですが、この場合遺伝子Aの3'末配列とタグ配列の間にいくつか(3で割切れる数の)余分な塩基をつけた方が良いのでしょうか?余分な塩基無しで直接タグをつけたところ、元のタグなし発現ベクターよりも発現誘導が格段に下がった経験があると先輩に言われ、どうしたものかと思っています。

遺伝子によってケースバイケースであるのかな?とは思っておりますが、皆様はどうされているでしょうか?直接タグを付けている、あるいは常に何ベース分つけるようにしている等、経験談を聞かせていただけないでしょうか?よろしくお願いします。
 
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グリシンを用いたリンカー 削除/引用
No.2009-5 - 2013/05/22 (水) 10:40:50 - Jujo
蛍光蛋白質など大きめのタグを付けるときに、グリシンを用いたリンカーを
制限酵素サイトに加えて設計している例があります。
グリシンはアミノ酸として側鎖が小さいので、タグ部分がぶらぶらと柔軟な構造を取ってターゲットの立体構造に影響を与えにくいというのを期待しているようです。

下記にベクターのプラスミド配列があり、例えば一番上のワードファイルには
http://ruo.mbl.co.jp/product/flprotein/fluo-chase.html
蛍光蛋白質とMCSの間にacc.ggt.aat,tcc,gct,gac.ggc.ggc.gga.gga.・・・とありかなり長いグリシンリンカーをつけています。
相互作用解析のための特殊なタグなのでタグとターゲットの距離を稼ぎたいのだと思いますので、ここまで長くなくても良いと思いますが、
ここのファイルにあるMCS配列とリンカーは何か参考になるように思います。

(無題) 削除/引用
No.2009-4 - 2013/05/18 (土) 14:08:35 - おお
答えはないというか、どう転ぶかわからないと思います。私のラボでは、C末にタグをつけるように、たぐの前にクローにんぐサイトをもうけたベクターを用意していますので、数ざんき余分のアミノ酸がつくようになってます。それで発現で困ったことはないです。

(無題) 削除/引用
No.2009-3 - 2013/05/18 (土) 09:45:10 - maru
遺伝子Aとタグの間に6bpカットの制限酵素サイトを入れたらどうですか?
タグ付きに入れ替わったことが制限酵素で確認できますし、今後別のタグを入れることになった時に使えます。

タグ付き発現ベクターを作る上で 削除/引用
No.2009-1 - 2013/05/18 (土) 07:00:55 - vector
よろしくお願いします。

現在すでに持っている遺伝子Aの発現ベクターを改変して、タグ付き発現ベクターを作成しようと思っています。この遺伝子Aでは5'側がcleveされることが分かっているので、タグは3'側につけます。

そこで、"ストップコドン直前までの遺伝子Aの3'末配列(20bp程度?)-タグ配列-stop codon(TGA)-制限酵素配列"に対するアンチセンスプライマーと、使いやすい制限酵素配列を含んだ遺伝子Aの末端から300bp程上流の配列に対するセンスプライマーとで、遺伝子A発現ベクターをテンプレートとしてPCRをかけ、制限酵素配列を利用して、できた産物を遺伝子A発現ベクターに組み込もうと思っています。

ここで質問なのですが、この場合遺伝子Aの3'末配列とタグ配列の間にいくつか(3で割切れる数の)余分な塩基をつけた方が良いのでしょうか?余分な塩基無しで直接タグをつけたところ、元のタグなし発現ベクターよりも発現誘導が格段に下がった経験があると先輩に言われ、どうしたものかと思っています。

遺伝子によってケースバイケースであるのかな?とは思っておりますが、皆様はどうされているでしょうか?直接タグを付けている、あるいは常に何ベース分つけるようにしている等、経験談を聞かせていただけないでしょうか?よろしくお願いします。

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