説明ありがとうございます。
ポジコンが上手く行っていて、タンパク無しで問題が起こらないのなら
やはり、タンパクに問題がありそうですね。
タンパクは抽出後ウエスタン等でチェックしてるんですよね？
タンパクの活性とかちゃんとしたタンパクが取れているという
検証はしていますか？
＞タンパク質は核抽出を10μg入れています。
とのことですが、もしかして、タンパクはタグ等で精製した物じゃなくて
核エクストラクトそのままですか？
もしそうなら、非特異的な結合が起こっている可能性が高いと思います。
また、エクストラクト中にその配列に結合するタンパクが何種類もある可能性もあります。
その場合はスメアになって目的タンパクによるシフトが検出しづらくなると思われます。
もしそうなら、結合していないオリゴのバンドの濃さが均一にならないのも
当たり前かもしれません。
（シフト自体は実際に起こっているが、非特異的なのでレーンによって量が違う。）
モヤモヤがどんな感じか分かりませんが、スメアの可能性もあるのではないでしょうか？
それが原因なら
一番良いのはタンパクを精製することだと思います。
無理なようでしたら、
非特異的な結合を抑えるため
poly(dI・dC)+タンパクを先に混ぜて何分か反応した後にオリゴを入れる
オリゴがGCリッチならPoly (dA・dT)を試す。salmon sperm DNAなどを入れる。
もし、核エクストラクト中の目的タンパクの濃度が低いのなら
目的タンパクの濃度を上げる条件を検討するか、エクストラクトの濃度を上げる。
塩濃度が上がってしまうので、エクストラクトの量を増やすのはあまりお勧めできません。反応系の1/10位にしておいたほうが良いでしょう。
とりあえず、目的タンパクが2-3μgぐらいは必要だと思います。
他にも、塩濃度やpHがタンパクとDNAとの相互作用に影響するので、
Mg2+, Zn2+, Ca2+, 界面活性化剤やスペルミジンなどを追加する必要があることもあります。
例えばジンクフィンガータンパクならZn2+を添加するのは絶対です。
もし、同じか類似のタンパクでEMSAしている論文があれば、それの条件を参考にする。
反応温度も関係あることがあるので、振ってみる。
という改善策が考えられると思います。
一番簡単にできるのはpoly(dI・dC)の順番等の非特異的な結合の排除
根本的な解決はタンパク精製かな？と思います。
エクストラクトじゃなくて精製タンパクを既に使っていたら添加物の検討で。
オリゴはその方法で問題ないと思います。
ゲルは私もAPS・テメド説を支持します。APSは溶解後１ヶ月位でダメになります。
要事調整が面倒なら、小分けにして冷凍しておくのが楽です。 |
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