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冷却PBSによる培養細胞の洗浄 トピック削除
No.2020-TOPIC - 2013/05/21 (火) 11:44:39 - KT
いつもフォーラム参考にさせてもらっています。
培養細胞からのRNA抽出(PCR用)のため、培地を除去後にPBSで洗浄、その後にlysisバッファーを添加しています。
その際のPBSですが、反応を止める意味で4度に冷やしたPBSを使用するように教わりました。それはそれで理解できるのですが、一方で細胞にとってはこれまで37度の環境にあったところを4度の状態になるのはストレスであり、遺伝子がその影響で動いてしまいノイズになるのでは?(むしろ37度のPBSが良い?)とも思っております。

みなさま、どのようにされておりますでしょうか?
ご教授いただければと思います。
 
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No.2020-7 - 2013/05/21 (火) 18:14:59 - 独り言
実験によっては確かに、大事な問題なんだなぁ。
例えば、リン酸化タンパク質を見るときとかは数分で変化おきるんだなぁ。一番良いのは、培地を吸引後、dishごと液体窒素で急速凍結しておくといいと聞いたんだなぁ。そのまま保存もできるし。

凍結しないにしても、
4℃のPBSか室温のPBSを使うのかも実験によると思うんだなぁ。室温だと、栄養飢餓の反応が起きるかもしれないし。

極端なことを言えば、培地を交換しただけでも、なんらかの変化が起こるんだなぁ。

みんな、自分に合った系でやっているんだなぁ。

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No.2020-6 - 2013/05/21 (火) 16:51:33 - TS
わたしは基本的には洗わない派です。WB、PCR、IHC、IPなどに持っていくサンプルが多いです。

うる覚えですが、細胞骨格か微小管構造なんかを免疫染色などで高分解能で観察する場合には、冷PBSだと構造が崩れることがあるから、37℃くらいを使うっていうのを聞いたこともあります。

実験によって対応すべきかと。

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No.2020-5 - 2013/05/21 (火) 15:42:46 - KT
ご回答ありがとうございました。目的は、マイクロアレイ用のRNAの抽出です。Cold shockによる遺伝子発現変化が気になり、今回お訪ねさせていただきました。特に冷えたPBSで洗浄する必要はなさそうですね。冷えた状態で実験する手間のことも合わせて、冷却PBSでの洗浄は行わないようにしようと思います(RNA抽出試薬には培地の影響アリと書いてありましたので、洗浄操作は行おうと思います)。

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No.2020-4 - 2013/05/21 (火) 13:19:43 - fen
RNA抽出試薬の組成はたいてい培地が混じってても影響しないようにできてるので、RNA抽出のためだけなら洗う必要ないですよ。ただ、冷えたPBSで洗ってcold shockをうけてもそれがRNA量の変動につながるには時間がかかるので、いずれにしても影響ないと思いますが。

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No.2020-3 - 2013/05/21 (火) 12:56:14 - Q
>その際のPBSですが、反応を止める意味で4度に冷やしたPBSを使用するように教わりました。

ちなみに、何の反応でしょうか?

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No.2020-2 - 2013/05/21 (火) 12:27:50 - おお
きょくたんには、pbsで洗う時点での変化がきになるので洗わないという人もいたかと。何を見るか次第じゃないでしょうか。。。わたしは室温であらいます、よほど興味のある遺伝子がそう言うことにセンシティブという情報とか、性質上その可能性がない限り。

冷却PBSによる培養細胞の洗浄 削除/引用
No.2020-1 - 2013/05/21 (火) 11:44:39 - KT
いつもフォーラム参考にさせてもらっています。
培養細胞からのRNA抽出(PCR用)のため、培地を除去後にPBSで洗浄、その後にlysisバッファーを添加しています。
その際のPBSですが、反応を止める意味で4度に冷やしたPBSを使用するように教わりました。それはそれで理解できるのですが、一方で細胞にとってはこれまで37度の環境にあったところを4度の状態になるのはストレスであり、遺伝子がその影響で動いてしまいノイズになるのでは?(むしろ37度のPBSが良い?)とも思っております。

みなさま、どのようにされておりますでしょうか?
ご教授いただければと思います。

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