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(無題) 削除/引用 No.2043-8 - 2013/06/03 (月) 05:00:53 - おお 興味深いですね。 すでに指摘がありますように、想像している以外のところにもカルシウムのデポジットがあるかもしれません。 http://en.wikipedia.org/wiki/Secretory_Pathway_Ca%C2%B2%E2%81%BA_ATPase ERいがいにもたとえば小ほうにもsecretory pathway Ca2+-transport ATPasesというポンプがあるようですし。thapsigarginの感受性はちょっとしらべきれていませんけど。 あとはERでもCaを放出するシステムを持ってない閉鎖した部分があればもしかしたらとも。 核からは多分ないと思いますが、、、 くわしいものではないので興味本位で想像しているだけですが。。。

(無題) 削除/引用 No.2043-7 - 2013/06/02 (日) 19:01:39 - み >[Re:6] カルシウムさんは書きました : > Thapsigarginで刺激して細胞質のカルシウムをFluo4、ミトコンドリアのカルシウムをRhod2で同時に追った後、さらに追加でイオノフォアを加えるともう一度それなりに大きなピークが両方で観察されるという事です。細胞外液はカルシウムフリーを用いていますので、小胞体内のカルシウムがリークしているのだと考えています。 確かにERのCaが空になるのかは疑問だけど、もう一点、SERCA-negativeのカルシウム貯蔵部位は存在しないのかな？っと思った(ミトコン以外でね）。 >SERCAを阻害してなぜ数十秒のスパンで大量のカルシウムが漏れてくるのか少し疑問にも思っています。IP3RやRyRがだだ漏れしている、という訳ではないように思うのですが、かなりの量のカルシウムが常に漏れ続けてSERCAによってくみ上げられ続けている、ということでしょうか。 刺激なしの状態でも一定の速度でIP3RやRyRから漏れているという事で良いのでは？それがpassive leakというものではないでしょうか。専門家ではないので間違っていたら済みません。 > Complete depletionというのは、特に標的分子の活性化、という訳ではなく、いくつかの遺伝子破壊細胞株や疾患由来細胞株を用いて小胞体内のカルシウム量を計測したいと考えています。 thapsigarginによる数分間〜10分程度のpassive leakの量を比較してstorageに差があるかどうかを見ている論文は存在しますよね。まあ僕が読んだものは差は無いというデータだったのでreviewerから深く追及されなかっただけかもしれませんが。 Caフリーの培地中でtahpsigarginによりER-Caを空にしておいて、Ca含の培地に戻してER-Caを充填して、その後何らかの刺激をしてCaトランジエントを観たりしている論文があったような・・・。 storage contentを論じていたのかSTIM-ORAI系の機能を観ていたのか忘れましたが。。。

(無題) 削除/引用 No.2043-6 - 2013/06/02 (日) 07:37:05 - カルシウム おお様 言葉足らずですみません。 Thapsigarginで刺激して細胞質のカルシウムをFluo4、ミトコンドリアのカルシウムをRhod2で同時に追った後、さらに追加でイオノフォアを加えるともう一度それなりに大きなピークが両方で観察されるという事です。細胞外液はカルシウムフリーを用いていますので、小胞体内のカルシウムがリークしているのだと考えています。 Thapsigarginは確かにcomplete depletionにはなり得ないのですが、そう書いてある論文も多々みかけましたので、そのような表現をしてしまいました。ただSERCAを阻害してなぜ数十秒のスパンで大量のカルシウムが漏れてくるのか少し疑問にも思っています。IP3RやRyRがだだ漏れしている、という訳ではないように思うのですが、かなりの量のカルシウムが常に漏れ続けてSERCAによってくみ上げられ続けている、ということでしょうか。 Complete depletionというのは、特に標的分子の活性化、という訳ではなく、いくつかの遺伝子破壊細胞株や疾患由来細胞株を用いて小胞体内のカルシウム量を計測したいと考えています。

(無題) 削除/引用 No.2043-5 - 2013/06/02 (日) 03:24:50 - おお thapsigarginはERにCaイオンを組み入れるのをブロックするわけだからcomplete depletionにはなり得ませんよね。 >SERCA阻害剤であるthapsigarginで刺激してもその後ionophoreでさらなるピークが観察されるので 想像するに細胞質のCaイオン濃度が上がるということですか?想像を加えないと内容がつかめません。。。 complete depletionってどの様な状態を考えているのでしょうか?Caイオンがあなたの考えているターゲットに影響しないぐらい低ければいいという考え方はしないのでしょうか(もしかしたらそう言う視点の実験じゃないのかもしれませんけど)。

ありがとうございます。 削除/引用 No.2043-4 - 2013/06/01 (土) 15:50:01 - カルシウム qqさんがおっしゃる通り、ionophoreだとミトコンドリアからの漏れがあると考えています。また細胞外への漏出もあるのではないかと考えています。できれば小胞体特異的に見たいのでthapsigarginを用いたのですが、前述の通り、TG処理後もまだまだ小胞体にカルシウムは存在しそうなのです。IP3R刺激とthapsigarginの組み合わせは試してみたいと思っています。 他にもよいアイディアのある方宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.2043-3 - 2013/05/31 (金) 22:56:47 - qq やったことありませんが、 １）ionophore入れると、ミトコンドリアのCaも出てくるかなあ？ ２）ionophoreは、細胞外のCaには働かない？細胞外からCaを取り込まない？細胞外へCaを放出しない？ ３）thapsigarginの後、PLCを活性化するようなリガンドの方が良いのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2043-2 - 2013/05/31 (金) 08:45:02 - Pumpkin Mammalが専門ではないのですが、私もCa動態に興味があり、 レスがつくのを楽しみにしていますが、きませんねぇ。。。

小胞体内カルシウムの総量 削除/引用 No.2043-1 - 2013/05/30 (木) 13:45:04 - カルシウム いつもお世話になっております。ポスドク歴はそこそこですが、カルシウムはほぼ初心者です。 現在細胞株を用いて、小胞体内のカルシウムの総量を計測したいと考えております。 Fura2やFluo4といった色素を用いた方法やカメレオンを用いた系などを持っているのですが、実際のところ小胞体内のカルシウムの量を完全に計測するためにはどのようなシステムがよいのでしょうか？ SERCA阻害剤であるthapsigarginで刺激してもその後ionophoreでさらなるピークが観察されるのでcomplete depletionではないようです。ionophoreとしてはA23187を10 uM用いているのですが、これが完全にdepletionを起こしているのか正直はっきりしないところです。 最終的には細胞を破壊して直接溶解液に色素を入れる事も考えているのですが、スマートな方法をご存知の方ご教授お願い致します。

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