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Cheap goods 削除/引用 No.207-12 - 2016/09/25 (日) 18:00:33 - Johnd942 I like what you guys are up too. This kind of clever work and exposure! edfebegdakdb

安全性の評価？それともその有機溶媒の使用法の探索？ 削除/引用 No.207-11 - 2012/02/28 (火) 09:57:52 - ~ 安全性の評価であれば、自社で勝手に実験系を立ち上げるのではなく、ISOに基づいた試験を行なってはいかがでしょうか。 様々な評価を自社独自に行なうというのはいい事かもしれませんが、標準的なものはありますよね。 http://www.platonjapan.co.jp/data3.htm 上記は有機溶媒ではありませんが、工業系の企業で生物学的安全性を評価するのに、ISOに基づいて行なっています。 （自社製品の副産物の？）有機溶媒で細胞から溶出されるタンパク質を得ること自体が目的なのでしょうか？ 揮発性の有機溶媒であれば、遠心後の上清を減圧乾燥で有機溶媒を飛ばし、適当な溶媒に溶かし、タンパク質量を測ることは出来るとは思いますが。 実用化を考えれば、その有機溶媒が含まれたままでもタンパク質量を測れないと売り物にならないと思います。 ただ、まずは回収量だけ調べて有効な成分を決めるのを先に行い、タンパク質量測定方法の開発は後に回してもいいと思います

lysis bufferの開発ではなさそうですね 削除/引用 No.207-10 - 2012/02/28 (火) 03:42:34 - カイ > 本来の目的は、ある有機溶媒の無生物、生物に対する影響を網羅する中で細胞に対する影響も見たいというものです。 有機溶媒が細胞に与える影響はいろいろだと思いますが、とりあえず100％の有機溶媒を加えたら細胞が見えなくなったから溶解を調べるということですね？ タンパク定量は難しそうですね。ここは他の方のコメントを待つとして、 100％の有機溶媒でいいのでしょうか？ 少量でも細胞に影響を与えるものはあるでしょうし、タンパクを溶かしだす前に細胞膜を傷つけるとか固定するとかで細胞を死なせるものもあるでしょう。 身近な有機溶媒で想像すると、フェノールクロロホルムが手につくと痛いというようなこととか、気化した有機溶媒を吸うと頭痛がするとか生体にダメージがあるとか、そういうことを考えました。 タンパク定量でいいのかな、というのもちょっと疑問なんですが。 実際的には製品の安全面のチェックということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.207-9 - 2012/02/27 (月) 23:18:09 - cvmn 皆様ご返信有難うございます。 大変多数のご返信に殆ど理解できておりません。。 工業系の中でも元々機械系出身のため、溶媒に関する知識は殆ど ありませんし、タンパク質なんて扱ったことがありません。 本来の目的は、ある有機溶媒の無生物、生物に対する影響を網羅する中で細胞に対する影響も見たいというものです。生物といっても細胞レベルで検証してくれと上司に言われ、たまたま細胞を扱った経験のあった前職者と交流のあった私が担当となったのですが、何をやったらよいか良くわかっていません。独りで試行錯誤状態です。 最初試しにリン酸バッファと呼ばれる緩衝液、又は対称有機溶媒に細胞を懸濁してみました。懸濁直後は両者とも透明でしたが、しばらく経過するとリン酸バッファではチューブの底に細胞と思われるものが見えました。有機溶媒ではそれは見えなかったので、溶けているのかなぁと思いました。見た目で判断ですと客観性が無いと思い、有機溶媒中には溶けたタンパク質を測定すれば客観的データが取得できると思いました。ただ、ご返信にありましたが、細胞にはタンパク質だけでなくＤＮＡなどもあるのですね。。ＤＮＡなどは高校でかじった程度です。

(無題) 削除/引用 No.207-8 - 2012/02/27 (月) 20:35:07 - カイ 失礼しました。Lowry法もOKでしたか。 普段使いのブラッドフォード、困ったときのBCAしか考えてませんでした（汗） 工業系のかたということですので、目的が気になりますね。 膜タンパクや核タンパクを活性や結合性を保ったまま効率よく回収するいいLysis buffer開発してくれたらいいような気がしますけど。

(無題) 削除/引用 No.207-7 - 2012/02/27 (月) 11:10:52 - TS 工業系ということで、とりあえずあまり細かいことを考えるより、作業を始めた方がよいということであれば、まぁいいんじゃないでしょうか。 タンパク質濃度だけを指標にするということだと、とりあえず以下のようなことを頭に入れておく（対応する）必要があると思います。 ・細胞には多様なタンパク質が発現しているので、全体的な溶解性（自分で書いててよくわかりませんが）が変わったのか、特定（複数）のタンパク質に対する溶解性が変わったのか、など、解釈にはそれなりに議論が生まれる。 ・Poolの大きなタンパク質が濃度に反映されがちなので、Poolの小さなタンパク質の溶解性の変化はあまり反映されなくなる。Poolの多いタンパク質をどれだけ溶かせるか、が結果を左右する。 ・溶媒によってBCA法などに若干の誤差を与えるため、溶媒毎にSTDが必要 最終目標がわかりませんので、それによると思いますが、 各細胞画分（膜タンパク質とか）をサンプルにしてみるとか、ゲルを流してパターンを比べるとか、先々に展開すべきことは見えてくると思います。

今度、いいLysis bufferが発売される？ 削除/引用 No.207-6 - 2012/02/27 (月) 10:14:38 - ~ ・溶媒の組成をみつつ、測定系の候補を選択する ・BSA等をスタンダードとして溶媒に溶かし、測定系の評価を行なう ・細胞数と測定値の直線性の評価を行なう ・細胞を溶かした溶媒にBSA等を加え、添加回収実験を行なう などの流れでしょうか。 溶媒によってはただ溶媒と混ぜ合わせるだけでは細胞が壊れず、ピペッティングなりソニケーションなりしないと溶けないかもしれませんが、そのあたりも含めての”溶解性”なのでしょうか？ パラメーターは溶媒だけでなく、溶媒と細胞の混ぜ合わせ方や添加後の操作も含まれると思います。

細胞障害アッセイキットは使えませんか 削除/引用 No.207-5 - 2012/02/27 (月) 09:43:34 - mon どのような溶媒か不明なので見当違いかもしれませんが、タンパク質濃度を測定する実験系が感度の問題で成立するか予備検討した方が良いと思います。培地に含まれる血清由来のタンパク質をしっかり除去しなくてはいけませんし、細胞をかなり濃いめに懸濁しないと、漏れ出たタンパク質濃度を精度良く測定できない可能性があるからです。大量の細胞を使えば良いかと思います。 通常は細胞内の酵素活性を測定する系が汎用されていると思います。 人工的に細胞をいじれるのでしたら、外来の酵素、例えば感度がよいルシフェラーゼや、緑色蛍光タンパクを発現する細胞を用意すると、定量性が高いと思います。ただし、用いる溶媒で活性が阻害されないことが前提ですね。 また今回の目的に合っているか不明ですが、細胞障害アッセイシステムとして、いろいろなキットが販売されていますので、一度検討してはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.207-4 - 2012/02/27 (月) 09:15:04 - qq >薄めてBCAじゃないと測れない、とかいうことです。 あらら、初耳。SDSだけの問題なら、Lowry法でOKでは？ ま、何にしてもトラップだらけであることは、同意しますね。

(無題) 削除/引用 No.207-3 - 2012/02/27 (月) 06:26:41 - カイ 溶媒に予定されているものがどんなものかわからないのですが… タンパク定量する際にもBCAやブラッドフォードなどがありますが、溶媒（lysis buffer?)に含まれるものによっては定量する系を阻害するものがあります。 compatibility, maximum concentrationなどで検索していただければそれぞれのアッセイ系で、使える最大濃度がわかるはずです。 たとえば、SDS10％を含む溶媒で溶かしたとして、溶解力は結構強いことが予想されますが、タンパク定量する際にはそのままじゃだめ、薄めてBCAじゃないと測れない、とかいうことです。 溶媒が有機溶媒なども含むとしたら、どうやってタンパク量測ればいいのかちょっとわからないな… 予定されている溶媒と、それに合うタンパク定量系で実験を組まれたほうがよろしいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.207-2 - 2012/02/27 (月) 05:34:38 - 印象 ふつうは、PBSなどに細胞をけんだくして（塊になっているとまずいので）、それからその液を加えるという感じかもしれません。 たとえば、水にケンダクすると、浸透圧の関係で多くの細胞がその時点で破裂します。 溶媒という用語がちょっと違和感がありますが、エタノールのような有機溶媒ではほとんどが溶解しないと思います。

溶媒のタンパク溶解量（細胞）定量について 削除/引用 No.207-1 - 2012/02/26 (日) 12:00:39 - cvmn お世話になっております。 現在ある溶媒間の細胞に対する溶解性を検討しようとしています。 細胞株を購入して各種溶媒に対する溶解性を見る方法ですが、 溶媒添加後に高速遠心して、上清に含まれるタンパク量の測定を 考えています。 細胞の培養に関しては以前在籍していた方に教えてもらったのですが、 工業系企業に在籍しているため、上記方法が正しいのかわかりません。 ご助言頂ければ幸いです。

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