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(無題) 削除/引用 No.2080-13 - 2013/06/14 (金) 00:22:29 - う 大変勉強になりました。 横道にそれてすみません。

(無題) 削除/引用 No.2080-12 - 2013/06/13 (木) 23:11:08 - AP なにか勘違いしているのかしら？ ttp://www.abcam.co.jp/Src-antibody-Clone-327-ab16885.html ttp://www.cellsignal.com/products/9935.html ttp://www.millipore.com/catalogue/item/MABS193

(無題) 削除/引用 No.2080-11 - 2013/06/13 (木) 22:42:08 - う AP様 ちなみに、どのanti-c-Srcのデーターシートで NIH3T3を使った結果が示してあるのか、 後学のために教えてもらえないでしょうか？ 私が知っているのは NIH3T3 transfected with c-Src ってのだけでしたので是非知りたいです。 あと、私が申しましたのは ＞SrcのC末端に関しては、リン酸化したことでシフトはしません。 （その部分の変異体で見たことあり） ですので、ご間違いなく。

(無題) 削除/引用 No.2080-10 - 2013/06/13 (木) 18:29:07 - AP いろんな会社からいろんなプロパティのanti-Srcが出ているけれど、多くの製品で3T3のライセートでWBのデモンストレーションをしている。また、リン酸化、非リン酸化でバンドがdoubletで検出されるかも（May appear as a doublet due to phosphorylation）と注釈されている製品もある。そうなるかどうかは、SDS-PAGE/WBの精度に因るだろうが、実際、そういう像を論文に載せている例もある。 ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3232246/figure/pone-0028587-g009/

(無題) 削除/引用 No.2080-9 - 2013/06/13 (木) 15:13:45 - う あと、ミリストイル化していないとしても、 バンドのシフトは見られません。 （変異体で確認したことあり）

(無題) 削除/引用 No.2080-8 - 2013/06/13 (木) 15:12:00 - う ウエスタンでリン酸化されたタンパク質が シフトして検出されることはありますが、 SrcのC末端に関しては、リン酸化したことでシフトはしません。 （その部分の変異体で見たことあり） そもそも疑問があるのですが、 NIH3T3で内在性のc-Srcは検出できるほど 発現していましたっけね？ そもそも、その２つあるというバンドのうち１つが c-Srcであるとどうして言えるのかが疑問です。 つまりは、v-Srcがきちんと発現しているのであれば、 内在性が検出できたとしても、 それを凌駕するv-Srcの発現が見えるはずです。 あと、言い出したらきりがないですが、 安定発現株の発現チェックをした、ありますが、 とりあえず薬剤選択前にトランジェントの発現を見ましょうよ。 知らないかもしれないと思いあえて書きますが、 安定発現株では、発現高い細胞をとることができるとは限りません。 薬剤耐性だったとしても。 v−Srcなら、その性質から、なおさらって容易に想像されますが。 もう少し、冷静に勉強することが必要かと思います。 長文失礼。

(無題) 削除/引用 No.2080-7 - 2013/06/13 (木) 00:45:29 - おお >[Re:4] APさんは書きました : > SDS-PAGEで実際はどうなるのかは知らないのだけれども、二本見えるバンドのうち上がリン酸化された不活性型、下のバンドがリン酸化されていない活性型だったりして。 おなじようなことかんがえたんだけけど、正常の下のバンドはmyristoyl lipid modificationされてないバンドかもとおもったりした。

(無題) 削除/引用 No.2080-6 - 2013/06/11 (火) 23:29:44 - qq NIH3T3にv-srcを安定発現させると、細胞はトランスフォームして、フォーカスを作るんじゃない？細胞コロニーの形態で区別できそうですけど？どうなんでしょうか。 その後でC-末のチロシンリン酸化の不在をウェスタンなりで確認すれば良いかなと思うのです。

(無題) 削除/引用 No.2080-5 - 2013/06/11 (火) 22:16:02 - Harmonia そもそもウエスタンブロッティングで見えるほどもタンパク質が存在するの？ シグナル分子がそんなにあって、細胞が大丈夫かなと、ふと思った次第。

(無題) 削除/引用 No.2080-4 - 2013/06/10 (月) 13:26:05 - AP c-SrcはC末端側のリン酸化部位Tryがリン酸化されると不活性型、脱リン酸化されると活性型となり、v-Srcはこのリン酸化を受けるTyrが置換してるため constitutive activeとなっているのではなかったかな。アミノ酸置換しただけのv-Srcとc-SrcはSDS-PAGEで見分けられないでしょう。 SDS-PAGEで実際はどうなるのかは知らないのだけれども、二本見えるバンドのうち上がリン酸化された不活性型、下のバンドがリン酸化されていない活性型だったりして。 一応Srcのリン酸化型、非リン酸化型を見分ける抗体はあるので、非リン酸化型の割合の上昇をもって、transfectionの指標としてはどうか。

(無題) 削除/引用 No.2080-3 - 2013/06/10 (月) 08:16:04 - ぽすどく タグをつけてはどうですか？

(無題) 削除/引用 No.2080-2 - 2013/06/10 (月) 06:56:13 - おお お使いのv-Srcがc-srcと違う場所にえいどうされることが今までに示されていますか?

v-Src安定発現株について、教えて下さい。 削除/引用 No.2080-1 - 2013/06/10 (月) 03:27:03 - 匿名 私はウイルスによってNIH3T3細胞にv-srcを発現させて安定発現株の作成を試みています。 発現チェックのためにウエスタンブロッティングを行ったところ、c-Srcと思われるバンドの下にもう１つバンドが検出されました。 ですが、よく見るとw.tのNIH3T3細胞にもc-Srcと思われるバンドの下にもう１つバンドが薄く検出されていました。 そもそもc-Srcもv-Srcも分子量があまり変わらないはずですが、ウエスタンブロッティングで発現を確認するにはどのようにc-Srcとv-Srcのバンドを見分ければいいのでしょうか？ ちなみに使っている１次抗体はMilliporeのGD11という抗体でc-Srcとv-Src両方認識するとの記載があります。 研究初心者なもので、至らないことがたくさんあるかと思いますが、どなたか教えてください。

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