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(無題) 削除/引用 No.2103-10 - 2013/06/15 (土) 12:49:40 - 7744 トライゾールでうまくいったという話を聞いたことがあります。

(無題) 削除/引用 No.2103-9 - 2013/06/15 (土) 11:38:15 - imr 何度もすみません。 脳に関しては半脳をそのままつけてあります。 分解に関しては保存状態が悪かったのが原因かもしれません。 ありがとうございました。 しかし、タンパク量が多いのは試薬量を増やしたらどうにかなるのでしょうか？ 何度も申し訳ないのですが、教えていただきたいです。

(無題) 削除/引用 No.2103-8 - 2013/06/15 (土) 11:28:18 - imr 肝臓は、100mgを6分割くらいしてあり、少し厚いかもしれないです。

(無題) 削除/引用 No.2103-7 - 2013/06/15 (土) 11:26:31 - imr ご意見ありがとうございます。 組織は１ヶ月程前に解剖後、RNAlaterに１日浸けておいたものを-30℃で凍結してあります。 実験の時は溶かして、30mg程度をハサミで切り取り、1mlのiso plusを入れたエッペンチューブ内でホモジナイズしています。 その後500μlのisoplusを加えてRNA抽出しています。 組織の状態としては、もしかしたらRNAlaterが浸透していないのでは？とも感じています。 液体窒素は試してみようかと思ったのですが、先生の許可が必要なことと、エッペンチューブ用の遠心機しかなあため、ラージスケールでできません。 少量でも可能なのでしょうか。 何度もすみませんが、お願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.2103-6 - 2013/06/15 (土) 11:22:38 - 直輝 肝臓を丸ごとRNAlaterに入れてるんですか？ 厚みが0.5cmになるようにスライスして入れるという注意書きを守っていれば大丈夫だと思うけど。

(無題) 削除/引用 No.2103-4 - 2013/06/15 (土) 06:02:54 - mon 経験上、溶解試薬量が全く足りない場合が殆んど。3~5倍使ってみてください。

(無題) 削除/引用 No.2103-3 - 2013/06/15 (土) 03:06:33 - ＿＿＿ もう少しポイントとなる部分を細かく書いてはどうでしょうか。 組織はどういう状態のものかとか、ホモジナイズするときにどういう液をどのくらい加えているとか。 乳鉢なら安全でNo.2103-2に書かれている通りですが、 量をさばく必要があるのなら大変かもしれません。 ポリトロンの刃は、見た目がきれいに洗浄できていれば問題ないでしょう。 RNaseは組織にたくさん存在しているので、容器や刃についてあまり心配する必要はありません。 試薬の種類や量を変えてみるなど試してみてもよいかもしれませんが、抽出前にすでに分解している可能性もあります。 260/280の値はあくまで参考で、何かの原因を追究するなら波形も見た方がもっと情報が得られるでしょう。

Pumpkin 削除/引用 No.2103-2 - 2013/06/14 (金) 20:13:22 - RNA 摘出後、速やかに液体窒素で凍結し、 すぐさま液体窒素下で乳鉢で磨砕して、 ファインパウダーにする。 これまた液体窒素下で秤とり、 RNeasy (Qiagen)で抽出。 生の状態でやると手技によっては、 RNaseからプロテクトできないときがあります。 グアニジン溶液でサンプルをけん濁するまでは、 決して溶かさず、けん濁したら決して冷やさず、 カラムから溶出したら、以降は冷やし続ける。

マウスの組織（肝臓，脳）からのRNA抽出 削除/引用 No.2103-1 - 2013/06/14 (金) 18:28:37 - imr 組織からのRNA抽出について質問させてください。 私の行なっている実験ではマウスの肝臓や脳からiso plusを用いてRNA抽出を行なっています。 最終的に抽出後，純度を測定すると，1.5−1.7程度で，ホルムアルデヒド変性ゲルを用いて泳動を行うと，バンドは2本出るものの，28srRNAは薄く，分解物が多い結果となります。 操作としては，RNA抽出の上手い先輩に見ていただいても特に問題は見当たらず，先輩が抽出を行なっても同じような結果となりました。 そこで私の考える問題点として，組織の破砕方法が問題なのではないかと考えました。 現在私の研究室で行われるRNA抽出の方法として，超音波破砕機を用いる方法，ホモジナイザーを用いる方法，注射針とシリンジで破砕する方法の3点で行われています。 超音波破砕機を用いて行うと，一時期RNAの純度は2.0と高いものが検出されていたのですが，最近は1.5くらいと低い純度のRNAしか抽出できなくなりました。また，変性ゲルで泳動すると純度は高くても分解物が多い結果となりました。 ホモジナイザーを用いて行うと，純度は1.6程度で，変性ゲル泳動すると超音波破砕機よりは少ないものの分解物が多いです。 加えて，私たちの研究室にあるホモジナイザーはポリトロンのPT3100で，刃は1つしかないため，1回1回RNase Quietで洗浄して使用しているものの，コンタミしている危険も感じます。 注射針とシリンジで破砕する方法では，1年ほど前までは上手くできていたのですが，現在1.5くらいの純度の低いRNAしか抽出できなくなりました。操作は変更していないので理由がわかりません。 抽出の上手い先輩でもRNA抽出が成功したり，失敗したりで，原因が分からないと仰っています。 どのようにしたら純度が高く，分解していないRNAが安定して抽出できるのでしょうか。特に組織の破砕の点でアドバイス頂きたいです。 長くなりましたが，よろしくお願いいたします。

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