BioTechnicalフォーラム [pET-DEST42でタンパクが発現されません]

pET-DEST42でタンパクが発現されません

No.2162-TOPIC - 2013/07/02 (火) 17:03:32 - GGG

イネのイノシトール代謝遺伝子を大腸菌で発現させようとしているのですが、うまくいきません。

今回はベクターとしてpET-DEST42を用いています。
以前にpET-28a(+)を用いて作ったベクターでは発現がうまくいっています。

改善策として、誘導温度やIPTG濃度を変えてみたり、抗生物質をアンピシリンからカルベニシリンに変更したりしたのですが、発現しません。

ribosome binding siteも確認しています。

特に、pET-DEST42を使ったことのある方、何かアドバイスがあれば、よろしくお願いします。
　

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pET-DEST42でタンパクが発現されません

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No.2162-12 - 2013/07/04 (木) 19:07:38 - GGG

>おおさん

>同じようなバンドの濃さでほかのMainなバンドとかさなってたらどうでしょうか。

>ウエスタンができないなら、バッチ精製とか簡便なほうほうで、少量のスケールでもいいですから、ものが濃縮された状況で見てみるのもてだとおもいます。

わざわざ図まで載せていただき、ありがとうございます。
確かに、予想分子量付近に大きなバンド（常に出現）があり、それと重なっている可能性はあります。

一度精製してみてバンドがでるかどうかを確認してみたいと思います。

>PBSTをつかっているようですが、菌株はなんですか?
>どちらもプラスみども同じ大腸菌をつかってますか。pLysSとかが入っているかどうかとかでおおきくちがうかもしれません。同時に菌の破砕方法も少し考慮が必要と思いますが。

菌株はどちらもBL21(DE3)です。
生成するときにはBugBusterを使用する予定です。

(無題)

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No.2162-11 - 2013/07/04 (木) 16:35:15 - おお

> >おおさん

> PBSTで溶かしたサンプルにサンプルバッファーを加えて泳動しているので、溶けなかったものは見れてないと思います。ウエスタンはやっていません。

http://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=3157419_1475-2859-10-56-2&req=4
たとえばここの図のBをみてください。lane 1と2はSDSPAGEで誘導前と後のCBB染色での比較のようです。矢印のところに目的のものがあると示していますが、これ矢印がなかったら見分けれますか?また、発現量がこの半分だったらどうでしょうか。

同じようなバンドの濃さでほかのMainなバンドとかさなってたらどうでしょうか。

ウエスタンができないなら、バッチ精製とか簡便なほうほうで、少量のスケールでもいいですから、ものが濃縮された状況で見てみるのもてだとおもいます。

> 情報が少なくてすみません。
> 大腸菌そのままサンプルバッファーに溶かすというのは可能なのでしょうか？

できますよ。あまり濃いとねんちょうになっちゃうので、まあそにケーしょんや、ニードルでさらさらな状態にすることはできますけど、そこまで濃くなくてもいいかと。目安としては、100ulの培養液から回収したなら同じボリュームにリカバーすればいいです。

あるいはPBSTで溶解した後のペレットだけをサンプルバッファーで回収してもいいかと。全部使っちゃうと後で精製がかなり困難になりますので一部だけでも。

>
> このままうまくいかなければpET-28aで作り直すことも考えているのですが、作業が簡単なことから今回pET-DEST42に挑戦し始めて最初の実験なので、できればうまくいってほしいと思っているところです。

配列が合っているなら全然発現しないことはないと私はおもってます。必要な量のタンパク質が必要な状態で取れるかというのがもんだいかと。

PBSTをつかっているようですが、菌株はなんですか?
どちらもプラスみども同じ大腸菌をつかってますか。pLysSとかが入っているかどうかとかでおおきくちがうかもしれません。同時に菌の破砕方法も少し考慮が必要と思いますが。

pET-DEST42でタンパクが発現されません

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No.2162-10 - 2013/07/04 (木) 14:57:10 - GGG

>うさん

私の書き方が悪かったです。すみませんでした。

>pET-DEST42で今回ベクターを作製した遺伝子と全く同じ遺伝子のpET-28aベクターがストックから見つかり、同じように発現を誘導したところ、発現が確認されました。

このことを

>コンストラクト、大腸菌のミスはないと思います。

の理由としているわけではないです。コンストラクトはシーケンサーで全長確認していて、大腸菌についてもプロトコルを確認しているのでミスはないものと判断しました。

(無題)

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No.2162-9 - 2013/07/04 (木) 14:10:13 - う

>pET-DEST42で今回ベクターを作製した遺伝子と全く同じ遺伝子のpET-28aベクターがストックから見つかり、同じように発現を誘導したところ、発現が確認されました。
コンストラクト、大腸菌のミスはないと思います。

ここからは、pET-DEST42に入れたものがコンストラクトとして間違いは無いとは

「言えない」と思いますけど・・・。

そういう基本的な考え方、チェックをしないと駄目だと思います。
先輩や担当教官にちゃんと教えを請いましょう。

pET-DEST42でタンパクが発現されません

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No.2162-8 - 2013/07/04 (木) 12:25:44 - GGG

>うさん

pET-DEST42で今回ベクターを作製した遺伝子と全く同じ遺伝子のpET-28aベクターがストックから見つかり、同じように発現を誘導したところ、発現が確認されました。

コンストラクト、大腸菌のミスはないと思います。

まだタンパクの実験を始めたばかりでどのような情報が判断基準として重要なのかわかっていない状態で質問してすみませんでした。

>おおさん

>PBSTに解けなかったものは見てないということですか?
>SDS-PAGEでチェックしたということは、ウエスタンはしてないですよね。

PBSTで溶かしたサンプルにサンプルバッファーを加えて泳動しているので、溶けなかったものは見れてないと思います。ウエスタンはやっていません。

>全体的に見て発現してないが、必要と思われるほどしてないだけなのかわか
>りませんし、ほんとに何にも発現してないなら(たとえばウエスタンで、大腸
>菌そのままサンプルバッファーで溶解して検出とかで)、なにか間違えもある
>かもしれませんし、たとえば全長はほとんど検出できないとなると、発現は
>するのだがそれ以外の部分を改善しないといけないとか、、、

>まあアドバイスしにくいんです。もとのpET-28aで実験できないのですか。

情報が少なくてすみません。
大腸菌そのままサンプルバッファーに溶かすというのは可能なのでしょうか？

このままうまくいかなければpET-28aで作り直すことも考えているのですが、作業が簡単なことから今回pET-DEST42に挑戦し始めて最初の実験なので、できればうまくいってほしいと思っているところです。

(無題)

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No.2162-7 - 2013/07/04 (木) 07:41:58 - おお

>[Re:5] GGGさんは書きました :
> >おおさん
>
> IPTGで発現誘導した後、PBSTに懸濁させたサンプルをSDS-PAGEでチェックしているのですが、それらしいバンドが確認できません。

PBSTに解けなかったものは見てないということですか?
SDS-PAGEでチェックしたということは、ウエスタンはしてないですよね。
>
>
> 以前にpET-28aを用いて発現させた（全く同じ遺伝子ではなく、同じグループに属している遺伝子）時に出たバンドが非常に明瞭でわかりやすいものだったので、何か重大な問題があるのではないかと思っています。

全体的に見て発現してないが、必要と思われるほどしてないだけなのかわかりませんし、ほんとに何にも発現してないなら(たとえばウエスタンで、大腸菌そのままサンプルバッファーで溶解して検出とかで)、なにか間違えもあるかもしれませんし、たとえば全長はほとんど検出できないとなると、発現はするのだがそれ以外の部分を改善しないといけないとか、、、

まあアドバイスしにくいんです。もとのpET-28aで実験できないのですか。

(無題)

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No.2162-6 - 2013/07/04 (木) 06:21:32 - う

聞こうと思ってて、やっぱりそうかと思ったことですが、
他のベクターでうまくいっているのが他のタンパク質って
(同じグループに属していても)、それがベクターの問題かどうかなんて、
何の参考にもならないと言っても過言ではありません。

それらはどっちも全長なのか？とか、

回答者にも、判断の基準として必要な情報も示さないところから感じるに
コンストラクトのミスや大腸菌の選択ミスなど

単純な基本的なミスをしているような気がして考える気がしないのは
私だけでしょうか。。。

いっそ他のベクターに変えたが早いとか。

pET-DEST42でタンパクが発現されません

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No.2162-5 - 2013/07/04 (木) 00:25:22 - GGG

>おおさん

IPTGで発現誘導した後、PBSTに懸濁させたサンプルをSDS-PAGEでチェックしているのですが、それらしいバンドが確認できません。

以前にpET-28aを用いて発現させた（全く同じ遺伝子ではなく、同じグループに属している遺伝子）時に出たバンドが非常に明瞭でわかりやすいものだったので、何か重大な問題があるのではないかと思っています。

(無題)

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No.2162-4 - 2013/07/03 (水) 23:24:51 - おお

どのレベルの検出感度で発現してないと結論づけたんだろうか、、、

pET-DEST42でタンパクが発現されません

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No.2162-3 - 2013/07/03 (水) 22:00:43 - GGG

>monさん

マイナーコドンについてはまだ調べていませんでした。ありがとうございます。

pETのマニュアルには目を通しましたが、一番原因として考えられた抗生物質を変えてみてもうまくいかなかったので他の原因を探っているところです。

(無題)

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No.2162-2 - 2013/07/03 (水) 20:06:28 - mon

大腸菌のマイナーコドンがイネ遺伝子に多いのではないでしょうか。
確かpETのマニュアル（日本語もあったと思う）には、いろいろとトラブルシューティングが詳しく載っていたハズですが。