BioTechnicalフォーラム [ODSカラムの洗浄]

ODSカラムの洗浄

No.2189-TOPIC - 2013/07/11 (木) 16:09:04 - とらねこ

逆相HPLCを用いてペプチドを分離精製しているものです。

ODSカラムの圧が急激に上昇してしまい、カラムを洗浄しようと思うのですがどういった条件で行うのが適切なのかご意見いただきたく書き込みいたしました。

サンプルは疎水性はそこまで高くない（30-40で溶出する）ペプチドですが、Tris-HCl bufferに溶解した形でアプライしています
これはTris-HCl buffer中でペプチドを反応させたためです。
塩を含むのは析出のおそれからよくないですが、ペプチドが少ないためロスをおそれて脱塩処理はおこなっておりません。
移動相は0.1 % TFA / アセトニトリルです。

疎水性の高いものが吸着しているのであれば、有機溶媒の比率を上げてやればよいのですが、今回の圧の上昇の原因はやはり塩が析出したことでしょうか？
だとしたらどういった条件が好ましいか、御教授いただければ幸いです。
　

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No.2189-5 - 2013/07/13 (土) 16:21:25 - HP

急に上昇した理由は多分書かれておられるとおりで、解決できるときもできないときもありますが、それより引っかかるのは、量が少ないCrudeなペプチドをODSにかけるというのは、ちょっとリスキーに感じます。収量はどうしてもそれほど高くはならないですし。

(無題)

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No.2189-4 - 2013/07/12 (金) 18:56:51 - とらねこ

みなさま、ありがとうございます

Trisの濃度は200 mMでした。
それを一回に20 uLほど注入して分離を行っていました。
ペプチドはcrudeのものでしたので、いろいろなものが混じっています。

10%ほどで有る程度流してから、低流速で一晩60-95％でwashをおこなってみたところ、カラムは汚れておりピークがちらほらと見られました。

しかし、まだ圧は高いままですので、逆にして95%を流してみようと思います。
（研究室の先生は圧が高くなると、逆にして流すと良いと仰るかたなので）

(無題)

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No.2189-3 - 2013/07/12 (金) 10:42:32 - mbb

最後の最後の手段としてですが、カラムの入り口側の
ねじを開けてほじくりとる、というのも可能かと思います。
精製用のカラムということであれば、ちょっと削り取っても
全く分離しなくなるということにはならないかと思います。

圧が急上昇した原因としては、塩が原因だとするとよほど
高濃度の塩をアプライしたということでしょうか？
20mMリン酸緩衝液を移動相につかうこともよくあるので
Tris緩衝液をアプライした程度でつまるのは、全くないわけ
ではありませんが、あまりない様な気がします。

(無題)

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No.2189-2 - 2013/07/11 (木) 16:54:30 - ~

まずは、HPLC用のカラムは消耗品だという認識を持っておいた方がいいかと思います。
また、インラインフィルターやガードカラムはつけているのでしょうか。
事前にのぞけるものは除いておきましょう。

汎用的な方法としては、
水：ACN＝5:5 ~ 0:10
あたりで微速で一晩。
塩を使っていますので、9:1でもいいのかも。
（100% ACNはカラムによくないという人もいますし、それで洗っている人もいます。）

流れないほど圧が高くなってしまうのであれば、カラムが死ぬことも覚悟した上で逆向きに流すこともあります。
（逆向き厳禁という人もいますので、ラボの自分よりも立場が上の人の方針は確認しておいた方がいいかも）

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No.2189-1 - 2013/07/11 (木) 16:09:04 - とらねこ

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