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(無題) 削除/引用 No.2190-15 - 2013/07/22 (月) 23:14:08 - tta ヒートショックと同じようなものかもしれませんが、シャペロン共発現させるとかはどうなんでしょう。培養条件の見直しから離れてしまうのでダメかな。 www.genefrontier.com/wps/wp-content/uploads/2012/09/PURE_%E8%AB%96%E6%96%87%E7%B4%B9%E4%BB%8B11.pdf

(無題) 削除/引用 No.2190-14 - 2013/07/22 (月) 14:54:24 - SUmmer-8 >>qqさん ヒートショックと同様の効果が得られるという噂（?）のエタノールは試してみました。 HSPが誘導されるそうです。3%ぐらい加えると良いそうです。 あまり目に見えた効果はなかったです。 >>おおさん 過去トピックの添付ありがとうございます。 ４年前のログですが、参考になります。 ラクトース誘導は商品化もされていますね。 http://www.merckmillipore.jp/life-science-research/overnightexpress-system/japanese/c_hHmb.s1O_XAAAAEd9pQ1tkwv この方法もIPTGをドカッと加えるよりも穏やかで良いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2190-13 - 2013/07/20 (土) 11:43:17 - おお ttp://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?start=1;mode=view;Code=2746 ttp://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=2190

(無題) 削除/引用 No.2190-12 - 2013/07/20 (土) 11:34:57 - おお >[Re:11] qqさんは書きました : > 与太話の戯言だと思っていただきたいのだけど、 > 発現誘導する前に、ヒートショック（42度で10分程度、ちょっと強めな方が良い）をかけてみるのはどうなんでしょう？ ヒートショックでヒートショックプロテインを誘導してリコンビナントを合成させるというのは昔ここで教えてもらって、文献もpublishされているようです。でもあまりやっているという話はききませんね。。。 IPTGでなくラクトースで誘導するというのもあったなぁ。。。

(無題) 削除/引用 No.2190-11 - 2013/07/20 (土) 11:10:56 - qq 与太話の戯言だと思っていただきたいのだけど、 発現誘導する前に、ヒートショック（42度で10分程度、ちょっと強めな方が良い）をかけてみるのはどうなんでしょう？ 発現させる事自体は、むしろ低温で誘導するとして、誘導前にHSPを誘導しておいて、変性しそうなタンパク質の回復をあらかじめ高めておくと言う考えです。 すでに誰かやっていそうでもありますが、あまり聞かない話なので、上手くいかないかもしれんけどね。

(無題) 削除/引用 No.2190-10 - 2013/07/19 (金) 21:48:09 - SUmmer-8 まだまだ試行錯誤の段階で、何一つ改善していませんので「解決」は押さずにおいておきます。 おおさん 丁寧なご説明ありがとうございました。 qqさん 大腸菌以外の系が手元に無く、設備も無いので、大腸菌に限らせていただきました などと言わずに試すべきだとは思います。

(無題) 削除/引用 No.2190-9 - 2013/07/16 (火) 22:55:28 - qq ＞大腸菌にゆっくり作らせるしかないのですかね。 ホストを大腸菌から変えるのは、どのくらい有効だったり、無駄な努力だったりするのかね？？ 大腸菌のタンパクを大腸菌でドカッと作ると、驚くほど簡単に取れますし、マンマルのタンパクをsf9で発現させる方が大腸菌より簡単だったことがあります。大腸菌より酵母の方がネイティブに得られるということはないのかなあ？

(無題) 削除/引用 No.2190-8 - 2013/07/12 (金) 22:29:26 - おお >[Re:7] SUmmer-8さんは書きました : > >おおさん > >あとはマイルドなカオトロピックイオンなどは場合によっては有効かもしれません高濃度LiCl、MgCl2、ClO4-とかI-とかいくらかそう言うのがありますが、あまり一般的には使わないですけど、、、たまに疎水結合などをきるのに使われます。 > > これは初耳です。確かにイオン強度を上げるのは有効だと思います。 ちなみにこれらのイオンは高濃度で疎水結合をきるので、単なるイオン強度の高い状態とは少し異なります。

(無題) 削除/引用 No.2190-7 - 2013/07/12 (金) 16:18:21 - SUmmer-8 >おおさん >構造を決めるような研究しているいくらかのグループはまずはゲル濾過をかけるそうで、それでなるべく変なあぐりげーしょんをしているものをのぞくか、あるいは溶出のプロファイルを見て、つかえるかどうか決めているというところもあるようです。 私は構造屋なので、まさにおっしゃる通りの状況です。 ゲル濾過で変なアグリゲーションばかりになってしまったのですが、そこで使えないと決めずに、 なんとかしたいと思い、あがいております。 >アルギニンなどのアミノ酸はたしかにある程度効果があるかもしれませんが、よくきくのは、蛋白の安定化でまずちゃんとした構造になっている蛋白が得られた場合のほうが有効なのかなぁという感じはします。 アルギニンは学会等で話は聞くのですが、私のまわりにはおりませんので、参考になります。やはり魔法の薬ではないのですね。 界面活性剤やウレアは無理矢理可溶化させている気がして、選択肢には入れてませんでした。低濃度のウレアというのも検討してみます。 >あとはマイルドなカオトロピックイオンなどは場合によっては有効かもしれません高濃度LiCl、MgCl2、ClO4-とかI-とかいくらかそう言うのがありますが、あまり一般的には使わないですけど、、、たまに疎水結合などをきるのに使われます。 これは初耳です。確かにイオン強度を上げるのは有効だと思います。 いずれの試薬を添加するにしても、最終的には除きたいと考えています。 ただ、ミスフォールディングが原因だとすると、除くと同時に沈殿するかもしれないと危惧しています。 ミスフォールディングを起こさないように、大腸菌にゆっくり作らせるしかないのですかね。

(無題) 削除/引用 No.2190-6 - 2013/07/12 (金) 11:38:29 - おお >疎水性分子表面や とおっしゃっているように、フォールディングがうまくいかないとか、フォールディングする前に疎水性の部分がさらされて非特異な相互作用で蛋白のあぐりげーしょんはおこりえるとおもいます。 なので界面活性剤はそう言うものには有効な場合はあるとおもいます。 ご指摘のように可溶であっても、蛋白がアグリゲーションをおこしていて、サイズ的にあまりあり得なさそうな所にくるとか、ゲル濾過で高分子の方へブロードなパターンを示すばあいがあるようです。 構造を決めるような研究しているいくらかのグループはまずはゲル濾過をかけるそうで、それでなるべく変なあぐりげーしょんをしているものをのぞくか、あるいは溶出のプロファイルを見て、つかえるかどうか決めているというところもあるようです。 アルギニンなどのアミノ酸はたしかにある程度効果があるかもしれませんが、よくきくのは、蛋白の安定化でまずちゃんとした構造になっている蛋白が得られた場合のほうが有効なのかなぁという感じはします。 構造やさんは、可溶化のときに高濃度DTTを使うこともあるようです。または1Mとかそんなに高くないウレアを入れたりすることもあるようです。 あとはマイルドなカオトロピックイオンなどは場合によっては有効かもしれません高濃度LiCl、MgCl2、ClO4-とかI-とかいくらかそう言うのがありますが、あまり一般的には使わないですけど、、、たまに疎水結合などをきるのに使われます。 低温などものによってはうまくいくものもあるとおもいますが、その様なものを使う一つの理由はあまりたくさんいっぺんに合成しないというのもあるようです。またtranslationのスピードがおちればフォールディングの パターンもかわるだろうというのもあるかもしれません

(無題) 削除/引用 No.2190-5 - 2013/07/12 (金) 10:43:07 - SUmmer-8 質問が長すぎるのはよくないと思って削ったのですが、削りすぎて情報不足になってしまいました。 >>qqさん はい。大腸菌です。 大腸菌以外でも起こりうることなので（例えば、アミロイドは天然でも凝集する）、 限定する必要はないかと思います。 >>Qさん 私の認識としては、インクルージョンボディは大腸菌で発現する際にミスフォールディングして不可逆的沈殿になったものであり、アグリゲーションは大腸菌の細胞質内でフォールディングしている、あるいは多少のミスフォールディングのために、多量体形成をしている状態にあると考えています。この多量体とは生理学的に意味のある多量体ではなく、疎水性分子表面やフリーのシステインなどが原因となった”不均一”な多量体と思われます。 実際にはアグリゲーションを起こしていても、大腸菌抽出液では可溶性画分に存在し、見た目も透明、しかしながら、ゲル濾過クロマトグラフィにかけるとvoid領域に溶出するという例も多いと思います。より凝集が進めば、目に見えて沈殿することもあります。どこからが不溶性か？と言われると難しいのですが。 いずれにせよ、これらはインクルージョンボディとは異なる現象だと捉えています。 アグリゲーションしていても活性を維持しているタンパク質もあり、気にせずに（あるいは気づかずに）研究されている方も少なくありません。しかし、結晶構造解析、NMR、単粒子解析や相互作用解析では、アグリゲーションが解析の障壁となります。 >う さん タンパク質濃度は大きく影響すると思います。 しかし、高濃度にする必要がある実験だと難しいですね。濃縮のときの添加剤などで回避できた例などあれば教えていただけませんか。

(無題) 削除/引用 No.2190-4 - 2013/07/12 (金) 00:10:11 - う タンパク質溶液の濃度を高くしすぎない。とか。

(無題) 削除/引用 No.2190-3 - 2013/07/12 (金) 00:08:27 - Q そもそも質問者さんがおっしゃるアグリゲーションとは、肉眼で見える現象なのでしょうか？ 目に見えてアグリゲーションが起これば、それは不可溶性であるのではないかと思いますけど・・・。 不均一な多量体形成って、何をもってそうおっしゃるのでしょうか？ インクルーション、不可溶性、可溶性だけどアグリゲーション これらの違いって質問者さんはどう定義されているのかよくわかりません。

(無題) 削除/引用 No.2190-2 - 2013/07/11 (木) 21:36:19 - qq 答えの持ち合わせはありませんが、大腸菌で発現させたタンパク質を念頭に置いているのでしょうか？

タンパク質のアグリゲーションを回避する方法 削除/引用 No.2190-1 - 2013/07/11 (木) 20:26:25 - SUmmer-8 いつも勉強になっております。 今回、可溶性フラクションには来るものの、アグリゲーション（不均一な多量体形成）してしまうタンパク質について改善方法があればと思い、質問致しました。 このフォーラムでもよくある質問として「インクルージョンボディにくるタンパク質を可溶性画分へ誘導する方法」があります。その答えとして、培養法の改良による解決（低温誘導など）や可溶化剤（Triton, アルギニンなど）、コンストラクションの改良（可溶性タグ、pColdなど）が挙げられてきました。 これらの方法はアグリゲーション対策にも有効でしょうか。 コンストラクションの改良はアグリゲーションに直接的に関係しますので、重要であることは承知しています。しかしながら、例えば、培養条件を見直すことで改善することはあるのでしょうか。また、高濃度アルギニンなどは有効でしょうか？ 実験的には共通する部分もあるかとは思いますが、特にアグリゲーションに有効な方法が無いかと探しています。 よろしくお願いします。

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