BioTechnicalフォーラム [Native-PAGEからのウエスタンでバンドが出ない]

Native-PAGEからのウエスタンでバンドが出ない

No.2193-TOPIC - 2013/07/12 (金) 13:13:51 - おかか

植物の培養細胞から超音波破砕で得た粗酵素抽出液より、四量体を作る酵素をNative-PAGEからのウエスタンブロッティングで検出しようとしています。以前、活性染色で活性を持つバンドを確認できたので、ウエスタンでそのタンパク質を同定したいのですが、Native-PAGEではバンドが何も出ません。しかしながらSDS-PAGEではバンドが出ました。どうにかして非変性の状態で検出したいのですが、似たような経験がある方がいらっしゃったら助言をおねがいします。
一次抗体は、組換えタンパク質を抗原とした自作のポリクローナル抗体を、二次抗体にはＨＲＰ標識抗体を使用し、化学発光をＣＣＤカメラで検出しています。
　

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No.2193-7 - 2013/07/15 (月) 18:15:59 - AP

ブロットしてからも非変性の必要がありますか、それとも泳動だけネイティブならいいんですか？

たぶん、使っている抗体が変性タンパク質しか認識しない可能性があるので、後者であれば、ブロッティングの段階、またはブロットしたメンブレン上で変性処理をすればいいのだと思いますが。

BN-PGAEなんかではなく、まったくのネイティブだと思っているのと逆向きに流れているかもしれません。等電点や泳動バッファーのpHなんかはどうなっていますか。

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No.2193-6 - 2013/07/15 (月) 14:03:24 - qq

＞トランスファーはCBB染色で確認していますが、はっきりとスメアが出ていますので十分だと判断しています。
全てのタンパクがうまく転写された理由として十分でしょうか？
Native-PAGEの泳動条件がSDSのないTris-Glyを使い、Tris-Gly系の転写bufferで転写しているのであれば、そうかもしれません。
転写bufferとNative-PAGEのbuffer条件が異なっているのであれば、転写の際に逆向きに転写されるタンパクすらあるかもしれません。

私の場合、BN-PAGEのあと、Tris-Gly-SDS（SDS-PAGEの泳動buffer）にUreaを6M程度加えた液で、泳動後のゲルを15分2回程度リンスし、その後で転写し、まあまあでした。
タンパク質のSDS化が転写に有効かもね、ということです。

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No.2193-5 - 2013/07/13 (土) 07:00:06 - 名無し

単にその抗体が天然のものは認識できないんじゃね。最近はペプチド抗原で免疫することがおおいから、モノクロはもちろんだが、ポリクロでも抗原として認識する領域はかなり限定されるわけで、蛋白質が十分に変性しないとその領域に抗体がアクセス出来ないということはかなりあり得るとおもう。

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No.2193-4 - 2013/07/12 (金) 13:56:07 - おお

あ、あとだまされたとおもってフィルムでやいてみてください。使っているマシーンにもよると思いますが、私の使っているものは最新機種ほど感度はでませんが、フィルむとくらべると10倍とかそれ以上感度がちがいます(バンドが同じ程度でる露光時間を基準に感覚でいってますけど).

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No.2193-3 - 2013/07/12 (金) 13:40:37 - おかか

解答ありがとうございます。

トランスファーはCBB染色で確認していますが、はっきりとスメアが出ていますので十分だと判断しています。