全16件 ( 1 〜 16 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.2195-16 - 2013/07/14 (日) 20:12:28 - う 他の方の書き込みをあまり読んでいませんので既出かもしれませんが。 ライゲーション時のDNAがプレートに残っているから、偽陽性が出るのは有名な話と私は思っていたのですが。 私は試しにコロニーが無いプレートのところをすくい取ってPCRすると、 バンドが出ることは何度も確認しています。 なので、私はコロニーを別のプレートに碁盤目状に数個ピックアップして 4時間くらい待って大腸菌が増えたところで、それをもとにPCFします。

(無題) 削除/引用 No.2195-15 - 2013/07/14 (日) 11:38:27 - おお >[Re:14] せみさんは書きました : > >おおさん > たしかに可能性はありますが、ダイマーを拾ったりバックを拾ったりのような曖昧なものではなく、たしかにバンドがはっきり出ていることが多いです。 > ノンスペ、あるいは大腸菌の周りの核酸をテンプレートにしている、ということでひとまず納得しました。 > ありがとうございます。 一度PCRプロダクトをシーケンスしたらどうでしょうか。そうじゃないとはっきりしたことはいえないとおもいます。プライマーダイマーでもバック(私はノンスペのいみでいっているのですが)でもはっきりしたバンドがでたりしますし、大腸菌の周りのライゲーションプロダクトがそんなに簡単にかかるとしたらなば、なんでトランスフォーメーションあできてないのか不思議です。

(無題) 削除/引用 No.2195-14 - 2013/07/13 (土) 20:36:39 - せみ >おおさん たしかに可能性はありますが、ダイマーを拾ったりバックを拾ったりのような曖昧なものではなく、たしかにバンドがはっきり出ていることが多いです。 ノンスペ、あるいは大腸菌の周りの核酸をテンプレートにしている、ということでひとまず納得しました。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2195-13 - 2013/07/13 (土) 19:57:27 - おお ベクター側のプライまーがあまりよくないのでは、、、あと欲張っていっぱい菌をいれると、低分子に何か見える場合も(RNAとかとおもったり). ピックアップする大腸菌は見えるか見えないかぐらいの量で十分です。欲張ったうえで陽性がないので露光時間とか感度とかあげるもんだから何か必ずみえるとか。100とか200bpならプライマーダいまーとかも見えることがあるので、PCR productsが500-1000bpあたりにくるように設計するとか。へんなミスアニーリングをへらすなら、ベタいんとかデフォルトで入れておくといいかと。 もし、大腸菌の外にあるライげーしょんプロダクトが大腸菌ないのプラスミドが容易にかかるような条件で増えるほどなら、陽性のコロニーがあっても不思議ではないので、やはりノンすぺなんでしょう。 大腸菌内にもゲノムなど核酸はありますので、大腸菌の周りのDNAを落としても、でてくるノンすぺはあるとおもいます。ベクターないのプライまーの組み合わせでやっているなら大腸菌の周りのDNAがじゃまするかもしれませんけど。 ベクターインサートの組み合わせプライまーだとポジこんが取れないから余計に判定が曖昧になるだろうし、 まあ欠点の方をとるとあまり私はコロニーPCRはする気になりません。 使うシステムによりますがまあ5個とれば必ずインサートがはいったプラスミドが得られる程度になるようになるべくしていますので。

(無題) 削除/引用 No.2195-12 - 2013/07/13 (土) 19:31:44 - せみ >monさん 組成を変えたり2STEPでやったりは試していませんでした。 ありがとうございます。 >cDNAさん アドバイスありがとうございます。ご提示の方法ですが、ほとんど試していません。 というのもコロPはあくまで当たりの目星をつけるためだけの実験であり、どちらにしろプレップしてSequenceなりなんなり読むので、ここを改善することにあまり大きな意味が無いように思えるからです。 というのも、コロPはポスドクやボスの指示で、さも当然のステップのように学生に教え、それがうまくいかない学生たちはそのどうでもいいステップで地団駄を踏んでしまうという現象があるように思えます。 よく考えると原因の追求はあまり大きな意味を持たないのかも知れませんね。 すべてハズレならライゲーションやそれ以前の方法を改善するべきであり、コロPがworkするしないは二の次なのかも知れません。 コメントありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2195-11 - 2013/07/13 (土) 19:03:55 - ｃDNA 偽陽性で48-96個PCRして全部はずれというのはあまりに確率が低いですよね。 この状況はそもそもプレート上に出てくるコロニーに対するはずれの率もかなり高いという事ですから、そこの確立を上げられるように改善出来るのが一番の近道のように思えます。もちろん難しい遺伝子を扱っているとどうしようもないのですが。 ベクター側のプライマーはTmが高いものが多いと思うのですが、アニーリング温度を下げ過ぎてミスプライミングが増えている可能性は無いでしょうか？ tttさんのやり方でも変わらない様なら、大腸菌かベクターをテンプレートに片方のプライマーだけで目的物に近いバンドが出てしまっているのかどうかが分かりそうです。 プロダクトのサイズが変わるようにインサート内のプライマーを変えてもやはり偽陽性が出るのでしょうか？いつも同じぐらいのサイズのプロダクトになるように設計するせいで目的ではない配列を増やしているだけだとか。 私自身の実験では偽陰性が出ることが多くて、偽陽性がそんなに出るものだと、 不思議な印象です。

(無題) 削除/引用 No.2195-10 - 2013/07/13 (土) 17:16:27 - mon まあ、なんのためにcolony PCRを行うかですよね。 colony PCRを行う場合は、vector primer,insert primerも長目のものを使うことが多く、おお様のように20-25 cycle（可能なら2 step PCRで）で判定することが多いですね。増幅長は1kbほど。 colony PCR用反応液(taq系酵素）には1M betaine+Orange G（+XC)を入れています。利点は、菌体の入れすぎにある程度寛容、GC-rich鋳型に寛容、そのまま泳動可能。これなら1hr＋泳動で終わるので、選抜したクローンをmini-prep＞シークエンスして確定かな。

(無題) 削除/引用 No.2195-9 - 2013/07/13 (土) 16:42:52 - せみ >おおさん すいませんミスです。プライマーは常にインサート＋ベクターでやっています。 ベクター＋ベクターでは誰もあまりやっていません。安酵素なので5kbpとかは無理だろうとの判断でしょう。 >tttさん なるほど、それはプレート上の核酸を拾わないのでかなりSmartな方法ですね。 今度試してみます。 >Harmoniaさん PCR産物を読んだことはありませんが、プラスミドを読んだことはあります。 その場合、綺麗にインサート無しでベクターの両側が繋がってました。 つまり「たまたま」プライマーがベクターにミスプライミングして、さらに「たまたま」目的の長さのPCR産物ができた、という現象だったのでしょう… >APさん 両方共ベクターのプライマーは理想なのですが、インサートの大きさや時間を考えるとどうしても躊躇してしまいますね… >JJさん なるほど、よく考えるとその可能性が一番高いような気がしますね。 アドバイスありがとうございます。 皆様ありがとうございます。 回避法としては、そもそもコロPを省くか、出てきたコロニーを更に培養するか、ベクター＋ベクターでPCRするか、という方法がいいような気がして来ました。

(無題) 削除/引用 No.2195-8 - 2013/07/13 (土) 15:46:25 - JJ 大腸菌の場合、ヒートショックの後そのままプレートに撒くとライゲーションしたDNAも一緒に塗り広げてしまうので、どのようなプライマーの組み合わせでも偽陽性が出る可能性が高いですね。LBで前培養した後、菌を遠心して上清を除き、培地か水で再懸濁してから撒くと混入はかなり少なくなります。コロニーを液体培養で増やしてからPCRをすると偽陽性がでないのもDNAが培地で希釈されたからだと思われます。

(無題) 削除/引用 No.2195-7 - 2013/07/13 (土) 13:16:48 - AP >4.インサート側＋ベクター側のプライマーでPCR これならいちおう、ライゲーション反応液に投入したDNA断片がプレート上にスプレッドされたものをPCRで増やしてしまう危険性はある程度減りますが、インサートの片側だけでもベクターにライゲーションされて、しかも大腸菌には入っていない産物があると、増やしてしまう可能性はありますね。 プライマーは両側ともベクター配列にしたほうがいいと思います。 それでも、両側ともライゲーションされているけれど、大腸菌には入っていないという分子が高濃度でプレート上に存在していると、偽陽性を生じる可能性は排除できませんが。

(無題) 削除/引用 No.2195-6 - 2013/07/13 (土) 08:57:53 - Harmonia ぼくはPCRで調べることすらしたことがない（プラスミドを抽出して酵素カット） ので、状況が分かりませんが、このフォーラムでたびたび出てくる話題ですね。 で、素朴な疑問。 そのPCR産物をクローニングして、配列をみると、どうなっているのですか？

(無題) 削除/引用 No.2195-5 - 2013/07/13 (土) 07:41:30 - ttt 参考までに、私はコロPと言うのはやったことはなくて、チューブの液体培地にコロニーを植菌して3時間程振盪培養して培地がやや混濁仕掛けてきた頃に培地を1μlを取ってPCRする、という方法しかやったことがないのですが、擬陽性と言うのは経験したことがありません。擬陰性と言うのは結構経験有りますが。 コロPに比べるとチューブの用意と培養する分、手間と時間はかかりますが、もし擬陽性が大きな問題ならば試してみる価値はあるかも。

(無題) 削除/引用 No.2195-4 - 2013/07/13 (土) 07:23:42 - おお インサートの中のプライまーセットでやっているなら、バックグランドシグナルを拾いやすくなります。思い切ってサイクル数を減らしてみてはどうかと思いますが。もしそんなに長くなければ20サイクルで十分でしょう。 せめて片方だけでもベクターにあにーるするプライまーセットにした方がバックグランドを拾いにくいです。 たんに2、3種類のコンストラクトなら思い切ってコロニーpcrのステップを踏まないというのがいい選択しと考える人もまあまあいます。結局結論つかなくても、ミニプレップするでしょということで。

(無題) 削除/引用 No.2195-3 - 2013/07/13 (土) 00:54:45 - せみ >[Re:2] 直輝さんは書きました : > さんざん既出なので、過去ログを貼っておきます。 > http://kenkyuu2.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=1739 おお、さんざん既出だったのですね。 検索もせずすいません。 結局はReasonableな原因はよく分からない感じなんでしょうか。 ノンスペ→いくつかのプライマーセットでやっているのでおそらく無い。 コンタミ→インサートの中のプライマーなのでおそらく無い。 キメラ→？ 考えられる可能性としてはうまい具合に切れた中途半端なインサートがベクターに入ってる…ということぐらいでしょうか。 大腸菌に比べ酵母ではうまくWORKする印象があるのですが、不思議ですね。

(無題) 削除/引用 No.2195-2 - 2013/07/12 (金) 23:52:47 - 直輝 さんざん既出なので、過去ログを貼っておきます。 http://kenkyuu2.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=1739

コロニーダイレクトPCRの擬陽性 削除/引用 No.2195-1 - 2013/07/12 (金) 21:36:19 - せみ ご存知の通り、コロPはTFされた大腸菌や酵母を直接テンプレートにして、任意のプラスミドが構築されているかどうか調べる方法です。 最近後輩の学生を教えたり自分の実験をしていて気づいたのですが、コロPの擬陽性があまりに多いことが不思議でなりません。 手順としては、 1.ライゲーションやGatewayなどでプラスミドを構築 2.大腸菌へ 3.培養後、コロニーをピックアップ 4.インサート側＋ベクター側のプライマーでPCR という普通の手順なのですが、例えば48〜96個PCRして全部OK→プラスミド抽出してCutして調べると全部ハズレ、ということがあまりに多く見られます。 僕の実験だけそうなるのであればプライマーの非特異的プライミングも考えられますが、何人かの実験系でも同じ事が起こっているようです。 なぜコロニーPCRは擬陽性が多いのでしょうか。皆さんのお知恵を拝借させてください。

全16件 ( 1 〜 16 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---