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(無題) 削除/引用 No.2202-16 - 2013/07/23 (火) 10:15:33 - biolock 中年さん コメントありがとうございます。 ＞　既に納得されたようなので蛇足かも知れませんが、そもそものWikipediaの説明が誤解を招くような記述になっていますね。 説明、大変分かり易かったです。 ＞　新たにプラスミドを持っていない「空の」コンピテントセルに はい、よく理解できました。 Harmoniaさん コメントありがとうございます。 すみませんでした。 最初の疑問、 「目的遺伝子配列を挿入したプラスミドベクターをコンピテントセルに入れる際、もともとのコンピテントセルが持っているであろうプラスミドはそのままいると考えていいのですか？」 に対して、自分なりの考えも書きつつ回答を募ったつもりでした。 頂いた回答（ちょっとずれていたのもありましたが）に対して新たな疑問も出たので一緒に質問してしまったのが悪かったのだと思います。 今後は自分の考えは書かずにシンプルに質問するように心がけます。 リンク先、おもしろそうです！ 精読したいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2202-15 - 2013/07/22 (月) 21:17:06 - Harmonia 実際に実験していなくても疑問を質問するのはＯＫでしょう。 ただし、No.2202-11 でおおさんが仰っているように、質問を整理してから でないと、回答が多岐にわたり、こんがらがってしまいます。 いろいろ学習中のようですので、ご参考までに下記を上げておきます。 バイオよもやま話 http://www.sbj.or.jp/sbj/sbj_yomoyama.html

(無題) 削除/引用 No.2202-14 - 2013/07/22 (月) 11:58:55 - 中年 既に納得されたようなので蛇足かも知れませんが、そもそものWikipediaの説明が誤解を招くような記述になっていますね。 「まず、プラスミドを取り出し」の部分は、クローニングに使うための材料であるプラスミドをどのように手に入れるかを説明しています。そのプラスミドを持った大腸菌株を増やし、そこからプラスミドのみを精製する、という意味です。ですから、このときに使ったプラスミドを含んだ株はこの過程で死滅してしまい、以後の実験のステップには出てくることはありません。 そうして手に入れたプラスミド（一度、精製してしまえば、冷凍庫で保存すればずっと使えます）を、「次いで制限酵素で切断し、切断部位に増幅しようとするDNA断片(プラスミドと同じ制限酵素で切り出したもの)をDNAリガーゼで結合させる」ことにより、新しいプラスミドを作製し、これをクローニングして増やす目的で、新たにプラスミドを持っていない「空の」コンピテントセルに形質転換することになります。

(無題) 削除/引用 No.2202-13 - 2013/07/22 (月) 10:31:29 - biolock > AAAさん 分かり易い解説、ありがとうございました。 > おお　さん コメントありがとうございました。 すみません。実際に今実験を行っているわけではなく、トランスフォーメーションの勉強をしていてふと疑問に思ったことをこちらで質問させていただきました。（現在高校3年生です） 実際の実験での疑問以外は、この場では不適切だったようで大変申し訳ありませんでした。 > mon　さん コメントありがとうございます。 ＞　なんか質問がちぐはぐなので、ややこしいことになっているような？（私の思い違いなら申し訳無い） すみません。 私の疑問は一点、「あるプラスミドを増やしたいのに、その大腸菌のオリジナルプラスミドも一緒に増えてしまわないのだろうか？」ということでした。 ＞ まず、通常plasmidを全く持っていないコンピテントセルを使います。通常の実験では天然のplasmidをもった大腸菌は使いません。「天然のplasmid」の性質がよくわかっていて、それを利用するなら別ですけど。 そうなのですね。そのお言葉ですっきりしました。 ＞＞どのステップでプラスミド除去が行われているのか分りませんでした。 ＞そもそも、そのような操作をしないように実験を計画します。 私はてっきり天然の大腸菌（オリジナルプラスミドを持っている）を処理してコンピテントセルをつくるものと思っていたのですが、そういうことではないのですね。 補足先のpdfファイル、精読してみたいと思います。 プラスミドが増えるメカニズム（複製機構）について勉強できそうです。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2202-12 - 2013/07/21 (日) 10:17:38 - mon なんか質問がちぐはぐなので、ややこしいことになっているような？（私の思い違いなら申し訳無い） ＞目的遺伝子配列を挿入したプラスミドベクターをコンピテントセルに入れる際、もともとのコンピテントセルが持っているであろうプラスミドはそのままいると考えていいのですか？ まず、通常plasmidを全く持っていないコンピテントセルを使います。通常の実験では天然のplasmidをもった大腸菌は使いません。「天然のplasmid」の性質がよくわかっていて、それを利用するなら別ですけど。 ＞どのステップでプラスミド除去が行われているのか分りませんでした。 そもそも、そのような操作をしないように実験を計画します。 そのため、思考実験そのものがナンセンス気味です。もちろん、AAAさんが述べているような異なるのplasmidを共存させることもタンパク発現実験では汎用します。しかし遺伝子のクローン化はplasmidを全く持っていないコンピテントセルを用いて行い、得られた（抽出した）目的plasmidを異種タンパク発現を増強するplasmidをもった大腸菌に入れ直すことが多いです。 なお、2種のplasmidを有している大腸菌からどちらか一方のplasmidだけを取り出す方法もあります。大腸菌を溶菌して電気泳動等でplasmidの大きさで分けるのが簡単でしょうか。全塩基配列が明らかならいろいろと方法はあります。 大腸菌を生きたまま処理して、それぞれ一方のplasmidをもつ大腸菌だけ単離することはほぼ不可能です。 ＜以下、他の方も指摘していますが、補足＞ ＞プラスミドAとBが混在 天然のプラスミドはコピー数（大腸菌内のplasmid分子数）は厳密に制御されています。 例えば、pBR322は天然ではなく改変plsmidですがコピー数は20-40になります。汎用されているpUC系plasmidはpBR322からコピー数を制御するrop遺伝子を取り除き、複製起点(ori)配列にも1塩基の変異があるため、30℃では20前後、37℃では200-700コピーになるようです。https://www.sbj.or.jp/wp-content/uploads/file/sbj/8910/8910_yomoyama-2.pdf さらに「不和合性」という現象がori配列の異なる天然由来のplasmid同士で知られています。これは、どちらかのplasmid(Aとする）複製機構がもう一方のplasmid Bの複製を阻害するので、plasmid Bが「徐々に」大腸菌集団から無くなって行きます。 従って、遺伝子組換え実験では、「不和合性」が問題にならない複製起点(ori)配列を有したplasmid同士を使うか、同じ複製起点なら異なる薬剤耐性遺伝子を乗せて薬剤選択条件下で培養すれば、２種以上のplasmidを一匹の大腸菌内で混在可能です。但し、同じ複製起点を持っていてもそれ以外の配列の影響で複製効率に差が出ることが多いので、コピー数が同等でないことが多いでしょう（薬剤選択しないとどちらかのplasmidが消滅する）。

(無題) 削除/引用 No.2202-11 - 2013/07/21 (日) 02:16:41 - おお まずあなたが参照したプロとコールはどんな株を推奨していて、その株はプラスミドを持っているのか、そのた特徴を書いていないか調べてみるといいかと思います。またあなたが考えている実験で何をしようとしていてどんな株が念頭にあるのか それで改めて質問した方が回答が多岐にわたらずややこしくならないのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2202-10 - 2013/07/17 (水) 14:23:06 - AAA >>1.コンピテントセルの作り方をみてみると、 「カルシウムイオン存在下で冷却することによりDNAに対する膜透過性が増大させる」と書いてあるが、具体的にプラスミドＡを除去できるような操作が見当たらない。 2.ミニプレップ後に関しても該当するような操作が見つけられない。 この説明は恐らく単独のプラスミドを持つ大腸菌における説明です。 複数のプラスミドを持たせるのは特殊な場合ですから、一般論には 混乱を避けるために記載していないのでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2202-9 - 2013/07/17 (水) 14:18:06 - biolock > 天然の菌にこだわりがあるのですか？ とくにこだわりがあるわけではないのですが、 トランスフォーメーションの原理を勉強していて、ふと、 プラスミドＢを増やしたいのに本来のオリジナルのプラスミド（プラスミドＡ）も一緒に増えてしまったら問題は起こらないのだろうか？ ↓ もし問題が起こるのであれば、 1.実験で使用されるコンピテントセルには プラスミドＡを除去する操作が加えられているのだろうか？ あるいは 2.ミニプレップで抽出したあとにプラスミドＢのみを精製する必要があるのではないか。 ↓ 1.コンピテントセルの作り方をみてみると、 「カルシウムイオン存在下で冷却することによりDNAに対する膜透過性が増大させる」と書いてあるが、具体的にプラスミドＡを除去できるような操作が見当たらない。 2.ミニプレップ後に関しても該当するような操作が見つけられない。 ↓ プラスミドＡが混ざっていも問題が起こらないのであれば それはなぜなのか？ プラスミドＡよりもプラスミドＢが数的に優位になれば無視できると考えるのか？ と思い、質問させていただきました。 耐性プラスミドの話、よく理解できました。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2202-8 - 2013/07/17 (水) 14:00:49 - AAA >>私がプラスミドＡと言っているのは、もともと大腸菌が持っている本来のプラスミドのことです。 天然の菌が持つプラスミドという事ですね。勘違いしていました。 >>とありますが、大腸菌がもともと持っているプラスミドが最初から抗生物質耐性遺伝子を持っているということでしょうか？ これは一般的によくあることなのでしょうか？ 全てのプラスミドが耐性を持つという訳ではありません。しかし、天然の プラスミドが耐性を持つ事はよくある事です。プラスミドは生存に必須では ありませんが、宿主にとって有益な作用をする事が多いと言えます。 例えば細胞機能を補完したりとかです。耐性菌の出現はプラスミドが関わって いる場合もあります。様々な説がありますが、細菌から細菌へ耐性プラスミド が接合伝達によって移動し、新たな耐性を獲得するという事も自然には 起こっています。こういったプラスミドの使いやすい部分を残し改変したのが 普段クローニングに用いているベクターと呼ばれるプラスミドです。 >>プラスミドＢだけを増やしたいのに、プラスミドＡも一緒に抽出されてしまうと何か問題が起きないのだろうか、と思ったのです。 問題は起きるかもしれません。そうなった場合、プラスミドを落とす等の操作 が必要になります。また、抽出したプラスミドを分離するのも手です。」 >>この本来のプラスミドを除外したコンピテントセル、ということなのでしょうか? 天然の菌にこだわりがあるのですか？通常ルーチンではJM109やBL21など扱い やすく改変された菌株を用います。天然の菌を使った実験経験はないのですが その菌株を用いる場合はAを落とす事も必要かもしれません。ただAを落とす事 でどのような悪影響が出るかは定かではありませんが。

(無題) 削除/引用 No.2202-7 - 2013/07/17 (水) 13:36:23 - biolock AAAさん 追加で申し訳ございません。 > Bだけ入れたいのならば空の大腸菌を使わなければなりません。 これは私が一番最初の質問で書いた > それかコンピテントセルは、本来のプラスミドを除外しているものなのですか？ この本来のプラスミドを除外したコンピテントセル、ということなのでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.2202-6 - 2013/07/17 (水) 13:31:27 - biolock AAAさん、詳しい解説をありがとうございます。 さきほどの回答をこれから精読しようと思っているのですが確認させて下さい。 私がプラスミドＡと言っているのは、もともと大腸菌が持っている本来のプラスミドのことです。 トランスフォーメーションという方法を発見するきっかけとなった、 「大腸菌にはゲノムＤＮＡとは別に独自で複製するＤＮＡ分子」として見出された、オリジナルの、何も実験操作されていないプラスミドのことです。 このプラスミドＡの遺伝情報は実験において利用する予定のないものです。 > Bが入った事を確認するために、Bが持つ選択マーカ で選択圧をかけます。この時Aの選択マーカを同時に使う必要があります。 Bだけ入れたいのならば空の大腸菌を使わなければなりません。 とありますが、大腸菌がもともと持っているプラスミドが最初から抗生物質耐性遺伝子を持っているということでしょうか？ これは一般的によくあることなのでしょうか？ （耐性遺伝子は人為的に組み込まれるものしか想定していませんでした） > 両者を共存させたいのならば、 とのことですが、プラスミドＡに意味をもたせているわけではありません。 プラスミドＢだけを増やしたいのに、プラスミドＡも一緒に抽出されてしまうと何か問題が起きないのだろうか、と思ったのです。

(無題) 削除/引用 No.2202-5 - 2013/07/17 (水) 13:16:41 - AAA >>プラスミドＢの導入があまりうまくいかずもともといたプラスミドＡのほうが優勢であれば大腸菌の形質の変化が起こらない＝形質転換効率が落ちる、と思ったからです。 両者を共存させたいのならば、上記の通り二重選択をかけます。Aがamp耐性 BがCm耐性だとすると、AmpとCmを両方入れた培地でセレクションします。 Bの導入が上手くいかなければ、当然Amp耐性しかないのでコロニーは生育 しません。 >>上にも書いたようにプラスミドＢが優勢になればプラスミドＡの影響は無視できる、と考えに基づきました。 この考えに誤りはあるでしょうか？ 誤りです。最初からAが入っており、後からBが大量に入ったとしても、Amp Cmでセレクションすれば、両者が共存した菌体のみが選択されます。

(無題) 削除/引用 No.2202-4 - 2013/07/17 (水) 13:11:59 - AAA >>コンピテントセルのオリジナルプラスミドが残っている場合と残っていない場合があり、抗生物質による選択圧をかけて作成したコンピテントセルは後者にあたる、と理解しました。 トランスフォーメーション時以外でも抗生物質による選択を用いる場合があるのですね、知りませんでした、ありがとうございます。 少し勘違いしているようです。選択圧をかけない場合、必ずしも残っていない わけではありません。一部、プラスミドが脱落した菌体が存在するという事 です。こういった菌体が増えるのは好ましくないので、選択圧をかける訳です。 >>"他のプラスミドなどと共存させて用いるプラスミド"というのはこれはプラスミドベクター（大腸菌に導入するプラスミド）という意味と思ったのですが、これらはオリジナルプラスミドに何か影響を与えるのですか？ すみません、この"他のプラスミドなどと共存させて用いるプラスミド"とオリジナルのプラスミドの関係性が分かりませんでした。 pG-KJE8を例にあげて説明します。このプラスミドは分子シャペロンを発現するプラスミドです。分子シャペロンは、タンパク質の折りたたみに関与する タンパク質で、タンパク質の発現が上手くいかない場合によく使われます。 これを持った大腸菌に、例えばAというタンパク質をコードしたプラスミド を入れるとします。すると、場合によっては分子シャペロンの助けによって Aの発現が効率よく出来るようになったりします。 http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?unitid=U100004366 ここにpG-KJE8類の説明が記載されています。このように、複数のプラスミド を大腸菌に持たせる事で、大腸菌等の機能性を上げる事ができます。 例えば耐性を持たせたい理由でプラスミドを保持させている場合はお互い のプラスミドに関係性はなく、独立した理由で保持させていると言えます。 >>オリジナルのプラスミドが残っていてもそれ以上にプラスミドＢが導入されればその比率から無視できると考える、という考えでいいのでしょうか？ ちょっと考え方が違いますね。既にプラスミドが入っている菌をコンピテント として用いる場合は、両者を共存させたい場合です。Bだけを持たせたいのな らば、空の菌株にトランスフォームします。比率での無視は出来ません。 1/10^7とかの確立で入っているなら別ですが。。。 >>「反映」と書いたのは、 プラスミドＢが効率よく導入されれば大腸菌の形質が変化する、その効率が形質転換効率であると考えると これは間違いありません。Bが入った事を確認するために、Bが持つ選択マーカ で選択圧をかけます。この時Aの選択マーカを同時に使う必要があります。 Bだけ入れたいのならば空の大腸菌を使わなければなりません。

(無題) 削除/引用 No.2202-3 - 2013/07/17 (水) 12:22:21 - biolock AAAさん、回答ありがとうございます。 行間を読む力がなくて文章をそのまま読んで理解できたことをもとに返信させせていただきます。 しつこくてすみません。 まず、コンピテントセルに、本来のプラスミドが残っているかどうかについて。 > 操作の方法によります。例えば、プラスミドが入った菌株を培養するときは > 抗生物質による選択をかけますよね。これは選択圧をかけ続けなければプラ > スミドを持たない大腸菌も増えてしまうからです。よって、コンピテント作成 > 時に、選択をかけて培養した大腸菌を使っているならば恐らく大丈夫でしょう。 > 拡散によって外に出てしまうものも一部あるかもしれませんが。 > 実際にpKD46やpG-KJE8など、他のプラスミド等と共存させて用いる > プラスミドはたくさん存在します。調べてみて下さい。 > コンピテントセルのオリジナルプラスミドが残っている場合と残っていない場合があり、抗生物質による選択圧をかけて作成したコンピテントセルは後者にあたる、と理解しました。 トランスフォーメーション時以外でも抗生物質による選択を用いる場合があるのですね、知りませんでした、ありがとうございます。 "他のプラスミドなどと共存させて用いるプラスミド"というのはこれはプラスミドベクター（大腸菌に導入するプラスミド）という意味と思ったのですが、これらはオリジナルプラスミドに何か影響を与えるのですか？ すみません、この"他のプラスミドなどと共存させて用いるプラスミド"とオリジナルのプラスミドの関係性が分かりませんでした。 > >>そこにはプラスミドAとBが混在していると思います。それで問題はないのでしょうか？ > > はい。混在しています。ただし、コピー数が違えば存在の割合も違いますが。 オリジナルのプラスミドが残っていてもそれ以上にプラスミドＢが導入されればその比率から無視できると考える、という考えでいいのでしょうか？ > >>形質転換効率というのはこのAとBの割合を反映しているのでしょうか？ > > 同時に二種類のDNAを形質転換するわけではないでしょう。片方は既に入っているはずです。2種類同時にやる事も不可能ではありませんが、効率測定には > pUCやpBRを単独でトランスフォームします。 「反映」と書いたのは、 プラスミドＢが効率よく導入されれば大腸菌の形質が変化する、その効率が形質転換効率であると考えると プラスミドＢの導入があまりうまくいかずもともといたプラスミドＡのほうが優勢であれば大腸菌の形質の変化が起こらない＝形質転換効率が落ちる、と思ったからです。 上にも書いたようにプラスミドＢが優勢になればプラスミドＡの影響は無視できる、と考えに基づきました。 この考えに誤りはあるでしょうか？ 残りの御回答に関しては、よく理解できました。ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.2202-2 - 2013/07/17 (水) 11:27:57 - AAA 落ち着いて書籍を読んでみて下さい。自分で図を描いてみるのもいいですね。 >>目的遺伝子配列を挿入したプラスミドベクターをコンピテントセルに入れる際、もともとのコンピテントセルが持っているであろうプラスミドはそのままいると考えていいのですか？ 操作の方法によります。例えば、プラスミドが入った菌株を培養するときは 抗生物質による選択をかけますよね。これは選択圧をかけ続けなければプラ スミドを持たない大腸菌も増えてしまうからです。よって、コンピテント作成 時に、選択をかけて培養した大腸菌を使っているならば恐らく大丈夫でしょう。 拡散によって外に出てしまうものも一部あるかもしれませんが。 実際にpKD46やpG-KJE8など、他のプラスミド等と共存させて用いる プラスミドはたくさん存在します。調べてみて下さい。 >>そこにはプラスミドAとBが混在していると思います。それで問題はないのでしょうか？ はい。混在しています。ただし、コピー数が違えば存在の割合も違いますが。 >>形質転換効率というのはこのAとBの割合を反映しているのでしょうか？ 同時に二種類のDNAを形質転換するわけではないでしょう。片方は既に入っているはずです。2種類同時にやる事も不可能ではありませんが、効率測定には pUCやpBRを単独でトランスフォームします。 >>こう思ったのは、wikipediaのプラスミドの項目に 「大腸菌を用いた遺伝子クローニングでは、まずプラスミドを取り出し、次いで制限酵素で切断し、切断部位に増幅しようとするDNA断片(プラスミドと同じ制限酵素で切り出したもの)をDNAリガーゼで結合させる。」 と書いてあったからです。 はい。その記述に間違いはありません。ただ、2種類用いる場合は別です。 取り出すのは組換えしたいプラスミドです。すなわち、ベクターが入って いる別の菌株から取り出します。例えばpG-KJE8/BL21という株があったと します。これには市販の分子シャペロン発現プラスミドが入っているので 弄ったりはしません。 pUC19/JM109等の空ベクターを持つ菌株からpUC19を 抽出し、何らかの制限酵素で消化、リガーゼを用いてDNA断片Aを挿入します。 こうして完成したDNAを一度JM109などで増やしてから、pG-KJE8/BL21等の コンピテントセルにトランスフォームします。これでようやく完成です。 長くなってしまいました。書き損じありましたらすみません。 もう一度プロトコール集なりをよく読んでみて下さい。

コンピテントセルのオリジナルプラスミドについて 削除/引用 No.2202-1 - 2013/07/17 (水) 10:41:39 - biolock みなさま宜しくお願いします。 トランスフォーメーションについて原理を勉強しているのですがわからないことがあったので質問させてください。 目的遺伝子配列を挿入したプラスミドベクターをコンピテントセルに入れる際、もともとのコンピテントセルが持っているであろうプラスミドはそのままいると考えていいのですか？ コンピテントセルがもともと持っているプラスミドをプラスミドAとすると（複数ある場合もありますが）トラフォメで導入するのがプラスミドB。 コロニーピックアップしてミニプレップしたらプラスミドDNAが精製できますが、そこにはプラスミドAとBが混在していると思います。 それで問題はないのでしょうか？ 形質転換効率というのはこのAとBの割合を反映しているのでしょうか？ それかコンピテントセルは、本来のプラスミドを除外しているものなのですか？ こう思ったのは、wikipediaのプラスミドの項目に 「大腸菌を用いた遺伝子クローニングでは、まずプラスミドを取り出し、次いで制限酵素で切断し、切断部位に増幅しようとするDNA断片(プラスミドと同じ制限酵素で切り出したもの)をDNAリガーゼで結合させる。」 と書いてあったからです。 この”まずプラスミドを取り出し”というのが、本来のプラスミドを抜きだして入れ替える、という意味なのかなと思ったのですが だとしたらそれはどのステップで行われるのでしょうか。 コンピテントセルの作成はしたことがなくプロトコールをざっと眺めてみましたが、どのステップでプラスミド除去が行われているのか分りませんでした。 そもそも根本的な考え方が間違っているのでしょうか。 あほな質問で大変恐縮ですが、ご教示お願いいたします。

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