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purification of oligopeptides トピック削除
No.2214-TOPIC - 2013/07/19 (金) 11:18:19 - おお
for Arg. The side chain
of Lys was protected with the
tert
-butyloxycarbonyl group. After
assembly, the peptide was cleaved from the resin with 10 mL
TFA using 0.75 g phenol, 0.5 mL distilled water, 0.5 mL
thioanisole, and 0.25 mL ethandithiol as scavengers. The crude
product was precipitated by dry diethyl ether, dissolved in 10%
acetic acid, and freeze-dried.

ttp://www.enzim.hu/data/pdf/17226965.pdf

あるペプチド合成の文献をさんしょうしています。この手のことは専門から離れているので、実際の方法論などよく分からないところが多くありますので、質問をたちあげました。

dry diethyl etherはなんでしょうか。水分を完全に含まないものを言っているのでしょうか?dry diethyl etherによるペプチド沈殿は一般的なんでしょうか?
なぜこの文献に行き着いたかといいますと、trizolでRNA抽出後のフェノールと中間層から、比較的短いペプチドを抽出できないかなぁとおもって、フェノール含有溶液からペプチドを精製しているような文献を探していました。

応用な可能か検討がつく方がいらっしゃいましたらよろしくお願いします。

あ、もう一つ見つけた文献では
ttp://www.pnas.org/content/95/20/11520.full
Fmoc-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala-OH was synthesized on sasrin resin. The peptide was cleaved from the resin by 30% TFA in methylene chloride, containing 5% ethanedithiol and 3% phenol (3 × 20 min) without deprotection of the N terminus. The product was purified by HPLC.

resinからフェノールを含む溶液で切り離して、HPLCで精製とかいてます。これってC18カラムなんでしょうか。。。とこの記述のまえにシリカゲルでの精製がありますけど、、、

こういうのにファミリアーな方がいらっしゃいましたらご意見うかがいたいと思います。
 
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(無題) 削除/引用
No.2214-9 - 2013/07/24 (水) 00:34:25 - おお
あ、そうですね。冷却がいいですね。ご指摘の点考慮に入れてもう一度じぶんでよく考えてみることにします。

(無題) 削除/引用
No.2214-8 - 2013/07/23 (火) 12:47:23 - mbb
フェノールも水も沸点が高いので、ポンプはオイルポンプか
それに相当するダイアフラムポンプでないと中々飛ばしにくい
と思います。飛ばす量と温度にもよりますけど。
トラップとしてはNaOHや活性炭は良いと思います。ただこれらは
それほど効率がよくないと思いますので、理想的には冷却トラップ
をつけるほうが良いと思います。

(無題) 削除/引用
No.2214-7 - 2013/07/23 (火) 06:02:11 - おお
>[Re:6] mbbさんは書きました :
> 遠心エバポが使用できる環境でしたらよいのですが。
> もしエバポレーションが難しいようでしたら、窒素ガスなどの
> 乾燥ガスを加熱しながら吹き付けると比較的容易に溶媒を
> 飛ばせると思います。ただフェノールが入っているので、
> できればドラフトなり窓際なり、ガスがこもらないような
> 所で行う必要はあると思います。
> ガスチューブの先端にパスツールをつけるとやりやすいです。
> 加熱は湯浴やヒートブロックでもできますし、ドライヤーでも
> いいかもしれません。コツとしては、勢いよくガスを出しすぎて
> 液を飛散させないように、ゆっくりとガスを調節してください。

ありがとうございました。

簡易型スピードバックがありますのでそれをchemical hoodにもっていってと考えているのですが、このスピードバック内臓型のポンプがあまり調子がよくないので、外部ポンプをつけようと思っています(hoodないで)。でポンプをいためないように、吸い込んだものを活性炭やNaOHを通した方がいいだろうなあとおもっているところです。まあhoodないでもある程度の勢いで排出されるので外に出る量をへらすほうがいいかと思っていますので。。。何か落度などありましたらご指摘いただけるとうれしいです。

乾燥ガスを吹き付けるのは知りませんでした。これもかんがえてみたいとおもいます。

(無題) 削除/引用
No.2214-6 - 2013/07/23 (火) 03:50:24 - mbb
遠心エバポが使用できる環境でしたらよいのですが。
もしエバポレーションが難しいようでしたら、窒素ガスなどの
乾燥ガスを加熱しながら吹き付けると比較的容易に溶媒を
飛ばせると思います。ただフェノールが入っているので、
できればドラフトなり窓際なり、ガスがこもらないような
所で行う必要はあると思います。
ガスチューブの先端にパスツールをつけるとやりやすいです。
加熱は湯浴やヒートブロックでもできますし、ドライヤーでも
いいかもしれません。コツとしては、勢いよくガスを出しすぎて
液を飛散させないように、ゆっくりとガスを調節してください。

(無題) 削除/引用
No.2214-5 - 2013/07/22 (月) 20:50:07 - おお
>[Re:4] mbbさんは書きました :
> 私が合成していたときは真面目にナトリウム線で乾燥させていましたが、
> 実際は特級のジエチルエーテルで十分沈殿していました。ただし良く
> 冷却したものを用いた方がよいです。
>
> ただRNA抽出後のフェノール層はかなり含水していると思いますので
> うまく沈殿するか予想はできません。合成ではほぼ無水の状態で
> 行ってますので。
> もしその層から回収するのであれば、普通にエバポレーションしたあと
> 他の溶媒で溶解して液クロなどで分離したほうがよいのではないでしょうか?
>
> ちなみに文献に書かれているフェノールはスカベンジャーの役割として
> 入っているのではないかと思います。
>

くわしくありがとうございました。たいへんべんきょうになりました。いろいろ私も調べていくと、やはり合成の場合は量がおおく通常のRNA抽出で残ったものから考えると厳しいかもしれないと思いはじめていました。またジエちるエーテルで沈殿しないケースがあるかもしれないというのも目にしましたので、やはり一度エバぽレートした方がいいかという結論に至りました。
化学合成など全くやらないラボなので、乾燥のステップをどうするか思案中です。

(無題) 削除/引用
No.2214-4 - 2013/07/22 (月) 15:34:06 - mbb
私が合成していたときは真面目にナトリウム線で乾燥させていましたが、
実際は特級のジエチルエーテルで十分沈殿していました。ただし良く
冷却したものを用いた方がよいです。

ただRNA抽出後のフェノール層はかなり含水していると思いますので
うまく沈殿するか予想はできません。合成ではほぼ無水の状態で
行ってますので。
もしその層から回収するのであれば、普通にエバポレーションしたあと
他の溶媒で溶解して液クロなどで分離したほうがよいのではないでしょうか?

ちなみに文献に書かれているフェノールはスカベンジャーの役割として
入っているのではないかと思います。

(無題) 削除/引用
No.2214-3 - 2013/07/19 (金) 17:08:48 - おお
>[Re:2] qqさんは書きました :
> モレキュラーシーブという素焼きの粒のようなものを乾熱、放冷したものを、diethyletherの瓶にバラバラと入れて、上澄みを使うのかな(?)。

あーそういうのありましたね。そうするとやはり水分を考えているようですね。論文も水を含むサンプルに加えていますので、水を厳密に含まないものをつかう必要性が乏しいようにもおもえますね。


> 脱水しないでも普通に売ってるdiethyletherを入れると沈殿したし、そうしてました。
> 昔のペプチド抗体作りのプロトコールを探すと詳しいと思います。
>

なるほど、ものはやはりdiethyletherでいいのですね。でかなり一般的なプロとコールのようですね。ご指摘のようにペプチド合成の基本的な手順などをかいているもので、詳しく調べることができそうです。

ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.2214-2 - 2013/07/19 (金) 15:24:21 - qq
モレキュラーシーブという素焼きの粒のようなものを乾熱、放冷したものを、diethyletherの瓶にバラバラと入れて、上澄みを使うのかな(?)。
脱水しないでも普通に売ってるdiethyletherを入れると沈殿したし、そうしてました。
昔のペプチド抗体作りのプロトコールを探すと詳しいと思います。

purification of oligopeptides 削除/引用
No.2214-1 - 2013/07/19 (金) 11:18:19 - おお
for Arg. The side chain
of Lys was protected with the
tert
-butyloxycarbonyl group. After
assembly, the peptide was cleaved from the resin with 10 mL
TFA using 0.75 g phenol, 0.5 mL distilled water, 0.5 mL
thioanisole, and 0.25 mL ethandithiol as scavengers. The crude
product was precipitated by dry diethyl ether, dissolved in 10%
acetic acid, and freeze-dried.

ttp://www.enzim.hu/data/pdf/17226965.pdf

あるペプチド合成の文献をさんしょうしています。この手のことは専門から離れているので、実際の方法論などよく分からないところが多くありますので、質問をたちあげました。

dry diethyl etherはなんでしょうか。水分を完全に含まないものを言っているのでしょうか?dry diethyl etherによるペプチド沈殿は一般的なんでしょうか?
なぜこの文献に行き着いたかといいますと、trizolでRNA抽出後のフェノールと中間層から、比較的短いペプチドを抽出できないかなぁとおもって、フェノール含有溶液からペプチドを精製しているような文献を探していました。

応用な可能か検討がつく方がいらっしゃいましたらよろしくお願いします。

あ、もう一つ見つけた文献では
ttp://www.pnas.org/content/95/20/11520.full
Fmoc-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala-OH was synthesized on sasrin resin. The peptide was cleaved from the resin by 30% TFA in methylene chloride, containing 5% ethanedithiol and 3% phenol (3 × 20 min) without deprotection of the N terminus. The product was purified by HPLC.

resinからフェノールを含む溶液で切り離して、HPLCで精製とかいてます。これってC18カラムなんでしょうか。。。とこの記述のまえにシリカゲルでの精製がありますけど、、、

こういうのにファミリアーな方がいらっしゃいましたらご意見うかがいたいと思います。

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