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(無題) 削除/引用 No.2302-8 - 2013/08/18 (日) 17:20:45 - おお ノンすぺがでてるのでMgは減らした方がいいんじゃないかなぁ。

(無題) 削除/引用 No.2302-7 - 2013/08/18 (日) 14:30:34 - are いまはあまりしなくなりましたが、MgCl2濃度を増やしてみるというのは 一昔前のPCRでは常識でした。

(無題) 削除/引用 No.2302-6 - 2013/08/18 (日) 01:27:40 - ~ Light Cyclerということで、機械の問題に1票。 RT-PCRはブロックのPCR装置でやっていませんか？　Light Cyclerは（私が昔使っていたものと似たタイプなら)ブロックでなくエア(?)で暖めるので、温度管理が悪い印象です。リアルタイムの条件でブロック式のPCR装置でPCR、泳動すれば検証できます。

(無題) 削除/引用 No.2302-5 - 2013/08/17 (土) 09:55:29 - kodamataro 関係ないかもしれませんが、融解曲線などで判断しているとしたら、リアルタイムPCR装置のウェルの汚れはありませんよね。 かなり汚れます。 しかも見た目ではわかりません。 メーカーによっては校正などの項目で PCRプレートを入れないで、ウェル全体をスキャンすることが出来るのですが、FAMフィルター、ROXフィルターで撮影すると、何もサンプルが入っていないにも関わらず強度なシグナルが観察されることがあります。 ＝ウェルの汚れです。実験結果に強く影響します。 一度ご確認を。

(無題) 削除/引用 No.2302-4 - 2013/08/17 (土) 06:15:47 - おお 電気えいどうで見た目シングルにバンドがでても、ノンスペがかぶっていることはあるかもしれませんので、そういういみでは条件をきびしくしてみるのもてかと思いますが、もう検討してるのかなぁ

(無題) 削除/引用 No.2302-3 - 2013/08/17 (土) 02:40:29 - おお かなりいろいろやっているのにせいこうしてないとおもわれているようですが、、、そこまでやってだめなもんかなぁともおもうわけで。 特定のターゲットでそうなのでしょうか?もしそうならそのターゲットの配列(が部分的に)がゲノムなどで頻度に現れるとかないでしょうか? マシーンを疑う余地はないのかな。。。

条件検討の詳細を知りたい 削除/引用 No.2302-2 - 2013/08/17 (土) 00:39:24 - oli 様々な酵素をすでに試しているようなので、酵素の種類が問題に思えません。ダイマーができているという判断はどう行っていますか？ RT-PCRでダイマーができていないというのは、PCR後電気泳動をして、シングルバンドということで判断しているのでしょうか。リアルタイムPCRはメルティングカーブを見て判断しているのでしょうか。 もししていればその結果も教えて欲しいのですが、リアルタイムPCR産物とRT-PCR産物を同じ条件で評価していますか？リアルタイムPCR産物も電気泳動できますし、RT-PCR産物もサイバーグリーンを追加すればメルティングカーブが見れます。例えば、ライトサイクラーでRT-PCRを回しても電気泳動でシングルになるのでしょうか。 極論を言えば、RT-PCRでシングルになるのでしたら、RT-PCRミクスチャーにサイバーグリーンを追加してリアルタイムPCRを回せばいいだけのように思えます。当然ですが、RT-PCRとリアルタイムPCRの条件を揃えてください（温度変化のスピード等）。

リアルタイムRT-PCRでダイマー生成 削除/引用 No.2302-1 - 2013/08/16 (金) 17:41:31 - Tign+Kotatsu 現在、リアルタイムRT-PCRを行っています。 RT-PCRではダイマーや非特異的産物の増幅が見られませんが、 Light cyclerを用いたリアルタイムPCRではダイマーができて、うまく発現量を測定できません。 プライマー濃度を変えたり、条件検討はしていますが、なかなかうまくいきません。 プライマーも特異的プライマーをいくつか作成しましたが、同じ結果になってしまいます。 ということで、酵素を変えるしかないかなと思っていますが、 経験者の方でいい酵素を教えていただけないでしょうか？ これまでに、TOYOBO THUNDER BIRD、Roche FastStart SYBR Green Master、プロメガ Go Taq qPCR master mixを使ってます。

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