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(無題) 削除/引用 No.2303-9 - 2013/08/20 (火) 13:24:43 - よっしー 腸管上皮細胞は自家蛍光が高く出ると思います． 対処法は私も知りません． その辺りが問題となっている気がしますが如何でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2303-8 - 2013/08/20 (火) 12:35:46 - やまもと 免染ワーカーさん 御助言ありがとうございます。 やはり，内在性ビオチンの検出のためなのですね。 内在性ビオチンブロックの方法を教えてくださり，ありがとうございます。 今までの方法では全くブロックできていないですね。 ラボにフリーのストレプトアビジンとビオチンがないので，今はできませんが，ビオチンブロックができる手技と材料はいずれにしても必要だと思うので，購入させてもらおうと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2303-7 - 2013/08/19 (月) 13:24:19 - 組織 >[Re:5] やまもとさんは書きました : > 一次抗体-二次抗体を使う間接法というのは，未標識一次抗体と蛍光標識二次抗体を使う，ということですね。さっそくやってみようと思います。 その通りです。ラボに蛍光標識二次抗体があるのなら、試してみる価値はあると思います。ただ、この場合も二次抗体が内因性IgGと反応する可能性があるので、二次抗体がマウス組織と吸着済みかどうかをチェックする必要があります。 薄切後の乾燥は30分〜1時間くらいで問題ないと思います。あまり短くすると、染色中に剥がれる危険性があります。

(無題) 削除/引用 No.2303-6 - 2013/08/19 (月) 11:33:31 - 免染ワーカー 内在性ビオチンを検出してしまっているのではと思います。 私も、やまもとさんと同じビオチン化一次抗体に ストレプトアビジンalexa594で染めようと思ったのですが、 通常の未標識一次抗体に蛍光二次抗体の染色で得られた像と全く違って あれっと思いましたが、内在性ビオチンのブロッキングを すっかり忘れていたことに気づき事なきを得ました。 まず内在性ビオチンをフリーのストレプトアビジンでブロックします。 ストレプトアビジンは４分子のビオチンと結合するので 内在性ビオチンに結合したストレプトアビジンの残りの穴を フリーのビオチンで塞ぎ、洗ってブロッキング完了です。 うまくいくことを祈っています。

(無題) 削除/引用 No.2303-5 - 2013/08/19 (月) 10:58:06 - やまもと 組織さん 勘違いしていました。 一次抗体-二次抗体を使う間接法というのは，未標識一次抗体と蛍光標識二次抗体を使う，ということですね。さっそくやってみようと思います。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2303-4 - 2013/08/19 (月) 10:39:05 - やまもと 御助言ありがとうございます。 独り言さん 固定前にしっかり乾かしておいたほうが組織がスライドからはがれにくくなるので1時間以上乾かすように，と，ある教科書にあったので，そのようにしていました。乾燥しすぎでバックが出すぎてしまっているのでしょうか。短い時間で試してみます。 ４％パラホルムアルデヒドでもやってみたのですが，同じでした。教科書には固定方法いろいろありますが，私が見た中ではアセトンが多かったので，アセトンで固定していました。 ありがとうございます。 組織さん 内因性ビオチンはこれではブロックできていないのですね。是非，ネガコンをおいて試してみます。ありがとうございます。 すみません，よく分かっていないのですが，一次抗体-二次抗体（間接法）というのは，一次抗体の後，ビオチン化二次抗体をつけて，さらに蛍光標識ストレプトアビジンをつける，という方法と思っているのですが，そうではないのでしょうか？この場合も結局内因性ビオチンのブロックをしないといけないのですよね？ 実は，内因性のビオチンの影響を受けないために，と思って，一次抗体にFITCの標識がされているもの（FACS用の抗体です。）を使ってみたこともあるのですが，それでもうまくいきませんでした。抗体が悪かったのかもしれませんが，ApplicationにIHCのあるものが見つからず，諦めました。 あまり免疫染色のことが分かっておらず，とんちんかんなことを書いているかもしれません。申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.2303-3 - 2013/08/19 (月) 08:12:21 - 組織 通常の一次抗体-二次抗体を使う実験系（間接法）を使わないのは、形質細胞などの内因性IgGに対する交差反応を避けるためでしょうか。ビオチンの系はあまり使わないのですが、操作が多くなるのと、内因性ビオチンが問題になる印象があります。 書き込みを読む限りだと、一次抗体の質が悪いか、内因性ビオチンを抑えられていない（skim milkではブロックできないはず）気がします。 同じ標本・検出系で、他の信頼性の高い抗体ならうまく染まるのでしょうか？ 内因性ビオチンに関しては、一次抗体の代わりに抗体希釈液を置くネガコンと比べてみたらいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2303-2 - 2013/08/19 (月) 00:26:58 - 独り言 > (1)スライドを冷風で1時間以上かけて十分に乾かす。 １時間とは長いような。室温5-10分とかではだめだのでしょうか。 > (2)-20℃アセトンで5分固定。 パラフォルムアルデヒドとかは試してはないのでしょうか。

凍結切片の蛍光免疫染色 削除/引用 No.2303-1 - 2013/08/17 (土) 18:53:40 - やまもと まだ駆け出しの研究生です。 基本的なことなのだと思うのですが，教えてください。 マウスの腸管組織検体で，腸管上皮内リンパ球の蛍光免疫染色をしようとしています。抗マウスCD8抗体で染めたいのですが，なかなかうまくいきません。リンパ球だけでなく，腸管上皮細胞もCD8で染まってしまうのです。むしろ腸管上皮のほうが濃く染まってしまいます。 助言を頂けないでしょうか。 HEではきれいに染まるので，検体の問題ではないと思います。 検体はマウスの腸管をそのまま（未固定で）OCTコンパウンドで包埋し，エタノール・ドライアイスバスで凍結し，6μmに薄切しています。 染色プロトコールは以下の通りです。 (1)スライドを冷風で1時間以上かけて十分に乾かす。 (2)-20℃アセトンで5分固定。 (3)乾かした後，パップペンで組織の周囲を囲む。 以後湿箱 (4)ブロッキング（5％Skim milk in 0.05% Tween20, 0.2% BSA)室温30分 (5)TBSで10分×3回洗浄 この時，パップペンが一部はげてしまうので，さっと周りだけ拭いて，塗りなおししています。 (6)ブロッキング2（Goat Whole Serumに2.4G2(抗FcγR抗体）2000倍希釈）室温20分 ブロッキングは，よくわからないのですが，一応内因性ビオチンのブロッキングとFCRのブロッキングを別々で行っています。 (7)TBSで10分×3回洗浄 (7)1次抗体（Rat Anti-Mouse CD8α-Biotin)室温30分 　濃度を，x12.5, x25, x50, x100, x200，x500，x1000とふってみました。 　濃度が薄いとさっぱり見えなくなります。しかし，濃い濃度で，見えるようになると，腸管上皮が全部染まってしまいます。 (8)TBSで10分×3回洗浄 (9)ストレプトアビジンAlexa Flour 488　濃度x400 (10)TBSで10分x3回洗浄 (11)Fluorescent mounting mediumをたらし，カバーガラスをかける。 以上です。よろしくお願いします。

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