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ありがとうございます 削除/引用 No.2319-14 - 2013/08/27 (火) 14:30:58 - つんまる 大変参考にあるコメントをありがとうございます。 プロトコールを読んだ感じではそれほど難しいアッセイとは思っておりませんでしたので、気軽に「手近にあるもので試してみます」なんて言ってしまいました。 けっこうコツがいる作業なのですね。 考えた結果、今回はプラークアッセイ用の低融点アガロースを購入することにしました。 きれいに重層し、ムラなく染色しないとちゃんと判定できませんもんね。 熱すぎて細胞が死んでも困りますし。 余裕があったら、今後のために泳動用アガロース（ final 0.5-1%くらいで）でも試してみたい気がします。。。

(無題) 削除/引用 No.2319-13 - 2013/08/27 (火) 11:42:22 - AP >部分的に固まる前に均一に混ぜるのが難しいという印象です。 いやまさに、そのとおりで、私が低融点を強くすすめるのも、途中で固まってしまうからという問題ではなく（目的上、それは端から論外）、ゲル化温度が低ほど30℃なり40℃なりでの流動性がより高く保てるという点にあります。 低融点でなくても1%でやれば大丈夫というプロトコールは試す価値はありそうです。

(無題) 削除/引用 No.2319-12 - 2013/08/27 (火) 08:06:48 - mon >[Re:10] APさんは書きました : > 可能ということは、実際にそれでプレーティングして問題なかったってことでしょうか。 4%アガロースを混ぜてfinal1%で使用する方法では、綺麗に重層するのは難しかったです。 具体的には高温のアガロースを保温した培地に混ぜても濃度のムラが出来やすい難点がありました。 結局、70℃ほどの4%アガロースを55℃ほどの1.3x培地に混ぜてすぐに良く混合し40℃ほどのwater bathで冷まし、細胞に重層すると、「まあまあ」上手くいきました（それでもムラになるときもあった）。 部分的に固まる前に均一に混ぜるのが難しいという印象です。 結局2%アガロースを使用する方法で失敗がなくなりましたね。

(無題) 削除/引用 No.2319-10 - 2013/08/27 (火) 00:02:28 - AP いや、べつに何を使おうがうまく行ってればなんでもいいんですけれど。 こんな些細な事、論争するほどのことでもないですし。 >当初は4%アガロースで行いましたが、扱いづらいので2%に変更しました。 私が、普通のアガロースでは4%のストック液は無理といったのはまさにこのことで、母液（＝ストック溶液）として4%だと扱いが困難ということです。じつはNusieveのような低融点でも4%はメディウムと混ぜてプレーティングするのはかなり扱いがやっかい。 元来、プラークアッセイ用のアガロースはSeaplaqueのような、もっとゲル化温度が低く（30℃以下）、粘性の低い（そしてより高価な）アガロースでやるものであって、それに比べるとNusieveクラスのアガロースでも不自由はあります。 リンク先のプロトコールがDH10Bacを使っていて、自分が使ったことのあるやつなので当然そうだと一人合点して書いてしまいましたが、製造元というのはインビトロジェンのことで、Bac-to-Bacシステムのことを想定していました。まさに直前の書き込みにあるリンク先のやつです。 >また「低融点アガロースでない場合、高濃度での粘性が高すぎるので、この濃度のストック溶液は無理ですね。」とおしゃってますが、オートクレーブすれば可能ですよ 可能ということは、実際にそれでプレーティングして問題なかったってことでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2319-9 - 2013/08/26 (月) 22:10:36 - mon APさんとけんかするつもりはありませんし、低融点アガロースが有るならそちらをお薦めします。 またGrace+10%FBS培地をお薦めします。無血清培地だとなぜか失敗しやすかったです。 製造元のプロトコールとメーカーのプロトコールというのが具体的には分からないのですが、4%アガロースを使用しているプロトコールは以下にもありますね。 http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf 思い出しましたが、2% agarose+2x[Grace＋FBS]Mediumで行っていました。 当初は4%アガロースで行いましたが、扱いづらいので2%に変更しました。37℃前後でも「すぐには」固まらないので重層は可能ですよ。でも5分以内かな。プレート一枚分づつ調合・重層しましました。 なお終濃度0.5%でも通常のアガロースならある程度のゲル強度は有るので扱いは楽ですし、(透明度が高いので）プラークも視認しやすいと思います。 また「低融点アガロースでない場合、高濃度での粘性が高すぎるので、この濃度のストック溶液は無理ですね。」とおしゃってますが、オートクレーブすれば可能ですよ(4%電気泳動用ゲルを作るのも無理ではないですが泡が問題となりますね。お薦めしませんが）。 確かに60℃に保っても高粘性ですからピペットでは正確に取れないので、チューブの目盛りで量を合わせていました。

(無題) 削除/引用 No.2319-8 - 2013/08/26 (月) 17:12:18 - AP 後者のプロトコールで、Seakem GTGのゲル化温度は36℃前後なので、40℃まで冷ましても固まらないということでしょう（並のグレードだと40℃以上）。ただし、そのプロトコールではアガロース濃度0.5%と、製造元のプロトコール（1%アガロース）より低い濃度にモディファイしています。また、メーカーのプロトコールでは、4%アガロースのストック溶液と濃縮培地を混ぜるようになっています（培地の濃縮の限界からアガロースを濃いめにしとく必要がある）。低融点アガロースでない場合、高濃度での粘性が高すぎるので、この濃度のストック溶液は無理ですね。

(無題) 削除/引用 No.2319-7 - 2013/08/26 (月) 16:06:32 - mon ちょっと探してみました。 低融点アガロースを使っているものが多いですね。 例えば、 http://www.baculovirus.com/protocols/plaque_assay.htm でも普通の高品質アガロースを使ってる例もありましたよ。 http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/peranen/Kotisivunlinkit/Vectors/baculos.pdf

(無題) 削除/引用 No.2319-6 - 2013/08/26 (月) 15:30:19 - AP 溶解したアガロースを40℃を越えない温度まで下げて使用する必要がありますので、アガーや通常のアガロースでは出来ないでしょう。40℃まで温度を下げても固まらないというだけではなくて、高い流動性を持っていないと困難なので、あまり変なモノは使わないほうが無難です。

ありがとうございます 削除/引用 No.2319-5 - 2013/08/26 (月) 13:45:33 - つんまる みなさま、ありがとうございます。 低融点アガロースであれば代用可能なようですね。 とりあえず手元にあるアガロースやアガーで試してみます。

(無題) 削除/引用 No.2319-4 - 2013/08/25 (日) 09:55:15 - mon 10年以上前なので記憶が定かでないですが、核酸電気泳動用アガロースで代用したような。判定前にNeutralRedを重層して放置後ライトボックスに乗せてプラークを視認しやすくしました。 まっ、コントロールウィルス？でやってみるのが早いよ。電気泳動用アガロースにもいろいろあるのでダメなものも有るかもしれないし（最近のモノは品質が良いとは思う）。

(無題) 削除/引用 No.2319-3 - 2013/08/24 (土) 01:24:52 - おお あまり参考にはならないですが、アガロースより純度の低いアガーをつかって培養細胞をまくこともほかの実験でありますね。

(無題) 削除/引用 No.2319-2 - 2013/08/23 (金) 20:01:04 - AP 少なくとも低融点であるという条件は必要ですね。 細胞が火傷しない程度に冷ましても液状でなければなりませんので。 電気泳動用でも出来ないことないです。プラークアッセイ自体、なかなか上手に撒いて生やすのは難しく、プラーク用のアガロースにしたからといってうまくいくものでもないみたいです。

プラークアッセイのアガロース 削除/引用 No.2319-1 - 2013/08/23 (金) 12:59:22 - つんまる お世話になります。 バキュロウイルスを用いたタンパク質発現系をはじめたばかりの初心者です。 ウイルスの力価を調べるプラークアッセイでアガロースを使いますが、核酸電気泳動で使用しているアガロースで代用できますか？ 今回限りの使用になりそうなので、プラークアッセイ用のものをわざわざ購入するのがもったいないと思っています。

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