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(無題) 削除/引用 No.2346-9 - 2013/09/06 (金) 14:05:39 - N seven様 まさに、的を得るお答えをいただきありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2346-7 - 2013/09/06 (金) 10:33:46 - seven NGSで定量の必要があるのはライブラリ作成時のテンプレートDNA量とライブラリ作成後のライブラリDNA量です。 ライブラリ作成時は使用するキットの推奨する範囲に入っていれば問題ないです。また、この時点ではChipで濃縮がかかっていても、含まれるDNAの種類は未知なのでサンプル全体のDNA量をqPCRで測ることはできません。 ライブラリ作成後はライブラリに含まれるDNAの両端に既知のアダプターが接続されているのでqPCRでも定量が可能です。いろいろなところからNGSライブラリ定量用のqPCRキットが発売されているので、それを使用するのが良いと思います。 ライブラリの定量ではバイオアナライザーよりqPCRの方がよく使われています。 自分のところでNGSにかけるのでなければ、事前にランを行うところに連絡してそこで使用しているキットで定量を行うのが一番安全だと思います。

(無題) 削除/引用 No.2346-6 - 2013/09/06 (金) 10:14:56 - N TK-1様 無論、S/N比が高い抗体を用いてChIPを行うことが出来ればそれが理想だとは思いますし、そのような抗体を選択して行っているつもりです。 私が動かそうとしているilluminaのMiSeqは、フローセル上でクラスターをうまく形成させることが重要なステップとされており、そこでは数種のDNAライブラリー（私の場合）を混合し適当な濃度で持ち込む必要があるので、そこで正確なDNAライブラリー濃度を知る必要があると考えています。 ということで、質問をしていて自分の中で論点がずれていることに気付いたので修正させて頂きたいのですが、「調整したDNAライブラリーの濃度をqPCRでどうやって測ればいいのか」ということが疑問になります。これは付加したアダプターを認識するプライマーを用いてqPCRを行えば濃度が測定できるという解釈でよろしいということになりますか？ 一方、ライブラリー作製に持ち込むDNA濃度は「ある程度な濃度が知れたらよい」という解釈でよろしいですか？

(無題) 削除/引用 No.2346-5 - 2013/09/06 (金) 09:12:15 - TK-1 それは、ただ単に、QCの一つとしてanalyticalなqPCRで本来enrichされるべき配列がenrichされているか、あるいはbackgroundがそれなりに低いかを見るだけじゃないんですか？要するにChIPができているかを確認するだけです。 > ChIP後のDNA濃度を正確に測っておくことはChIP-seqに持ち込むために 重要なステップかと思われます。 そんな正確にはかる必要があると思うのはなぜですか。普通にやる限り（それなりの抗体でそれなりの人がやる場合）5-10ng位の量があればシークエンスをするだけなら問題ないです。それよりは、きっちりとS/Nが高いChIPができているかの方がよほど問題だと思いますが、その辺はどう考えているんですか。

(無題) 削除/引用 No.2346-4 - 2013/09/06 (金) 08:54:36 - N TK-1様 TK-1様の知る限りそういう手順を踏む人はいないということなのですね…。 以前、illuminaさんにMi-seqの講習会を開いて頂いた際にそう伺ったもので、いざやろうにもやり方が分からずここで質問させて頂いた次第でございます。

(無題) 削除/引用 No.2346-2 - 2013/09/05 (木) 12:35:59 - TK-1 qPCRでChip'ed DNAの濃度の測定なんかする人いるんですか？ その根拠は何ですか？

ChIP後のDNA濃度測定 削除/引用 No.2346-1 - 2013/09/05 (木) 08:50:09 - N いつもお世話になっております。 ChIP後のDNA濃度を正確に測っておくことはChIP-seqに持ち込むために 重要なステップかと思われます。 やり方はいくつかあるかと思いますが、qPCRで測定が最も推奨されており 次点としてはQubitやバイオアナライザーが用いられていると思います。 そこでお聞きしたいのはqPCRを用いてChIP DNAの濃度はどのようにして測ればいいのかということです。 実際にやっておられる方の手法や、文献などアドバイス頂けたら幸いです。

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