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(無題) 削除/引用 No.2359-23 - 2013/09/17 (火) 23:17:26 - おお まあ問題はこれまでの流れについてきて、前の回答に重複せずに答えれる人がいなくなってきている部分もありますね。一度整理しながら、少しご自身で調査などもやって、そこでピンポイントに質問した方がいいかと思います。次々と質問されるのでいい気がしないという方もいますが、こうやって議論できるのはいろいろプラスになることがありますので、いい影響があるとおもいますし。 mitogenで変異が促進される理由として活性酸素が上がってましたが、なるほどとおもいました。mitogenなど活性酸素量を上げます。分裂の激しい細胞は活性酸素量も多いようです。

(無題) 削除/引用 No.2359-22 - 2013/09/17 (火) 19:17:16 - なお U2さま、おおさま、~さま 大変ご丁寧にお答え頂きまして、本当にありがとうございます。 とりあえずかもしれませんが、私が抱えていた疑問を解くための重要な手掛かりは頂くことができたと思っています。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2359-21 - 2013/09/17 (火) 19:01:41 - U2 Transformationの定義は機能的な表現形（接触阻害からの離脱、足場非依存性増殖、造腫瘍性）であり、その原因の一つとしてmutationなどのgeneticな変化が挙げられるという事です。その他に色々な原因があるのかもしれませんが、きちんと証明されているものを私が知らないだけで、 すべてのtransformationがgenetic eventsで説明されるとは言えません。他の方々の意見も参考にしてみると良いと思いますよ。 Mitogenの影響については、シグナル伝達そのものではなく、その結果として生じる不可逆的なプロセスが問題だと考えています。細胞周期そのものは、形質転換していないNIH3T3でも十分回っているので、それ以外の原因を私なら考えます。DNA damageが関与している可能性は高いと思います。 Early passageの意味は、後者（passage回数が少ない）です。Passageを繰り返せば、genetic eventsが蓄積すると思います。 コンフルエント培養で見られる浮遊細胞については、なおさんの実験条件で見られる細胞を解析してみないと分かりません。顕微鏡下の観察で明らかなアポトーシスの形態的特徴が確認できれば、死細胞（あるいは死にゆく過程にある細胞）と言えますが、はっきりしなければ、浮遊細胞を集めて継代してみる、あるいは細胞増殖、細胞周期、細胞死などのアッセイにかけてみるのは、良いアイデアだと思います。 細胞周期が止まっている細胞については、色々な分野で面白い研究が進んでいると思います。私の研究領域では、oncogene-induced senescence(OIS)という現象が知られており、OIS細胞は G0/G1で止まっているけれど、長期にわたって生存し、metabolic activityが高い事が分かってきています。このように、細胞周期が止まっていても、生存して機能する細胞が、癌化のプロセスの初期に見られる事からも、細胞周期のアレストが必ずしも細胞死とリンクしない事は明らかです。 足場依存性の細胞の場合は、細胞周期とは無関係に、integrinなどの細胞接着因子を介したシグナルが細胞の生存に必要なのだろうと推測しますが、transformした細胞では、それを代償する機能（例えば、RASやRAFの変異によるMEK-ERK MAP kinase経路の恒常的活性化）が獲得されているのだと思います。

(無題) 削除/引用 No.2359-20 - 2013/09/17 (火) 18:17:47 - 通りすがり スレ主さんへ次から次へと質問するのは見ててあまり良い気分はしませんね。質問しすぎだと思います。 いろいろ情報が得られたので、あとは論文各種を読んだりして仮説を立てて自分で実験してみたらどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2359-19 - 2013/09/17 (火) 17:30:19 - とりあえず >[Re:15] なおさんは書きました : > >[Re:14] とりあえずさんは書きました : > > anoikisを勉強してみては。 > > あと、細胞周期が回っていないと細胞が死んでしまう、という先入観にとらわれすぎない方がよいと思いますよ。 > > 神経細胞などのG0期にいる細胞の存在を知っておりますので、そのようには考えておりません。今ここでは足場依存性の株化細胞について伺っております。 で、anoikisは勉強したの？

(無題) 削除/引用 No.2359-18 - 2013/09/17 (火) 15:53:51 - おお 細胞がコンフルになった後、ぺろっとはがれるようなものは何らかの理由で死んでいる細胞が出てきたときに多いです(経験上)transformした細胞はディシュにつかないというわけでもないので、パイルアップしたりして一部浮遊してくることが多いのではと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.2359-17 - 2013/09/17 (火) 15:49:03 - おお 内容的にかなりクオリティーをあげていかないとカバーできなくなってますし、大学の講義に匹敵するぐらいになってます。なかなかそう言うのをカバーするのは簡単なQAでは難しいですし、わかることはなるべく書こうと思いますが、癌や関連する事についてかかれた本や、レビューなど少しあさって落ち着いて読まれた方がいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2359-16 - 2013/09/17 (火) 15:39:57 - おお >[Re:13] なおさんは書きました : > あと、加えてみなさまに伺いたいのですが、トリプシンではがした細胞では、細胞周期以外の、代謝や膜機能などの生命機能はどうなっていると考えられるのでしょうか？コーティングしていないディッシュにまくとNIH3T3などの株化細胞って増殖できず死んでしまいますよね。でも細胞周期が止まっている（増殖しないとしたら少なくともM期直前で止まっていると考えられる）としても、それ以外の細胞機能が働いていれば、増殖せずにずっと生きていられるような気がするのです。実際にはそうならないということは、接着できない足場依存性細胞は、接着できないと細胞周期だけでなくそれ以外の細胞機能もすべて滞っていると考えてよいのでしょうか？ > よろしくお願い致します。 細胞周期をコントロールできるというのは細胞が機能してコントロールできるからではないでしょうか。一方細胞が死ぬというのは2通りの死に方があります(ただしクリアーにどっちと分けれないけーすもおおいかもしれませんが)。一つはprogramed cell deathで、自分から腹をきる方法です。で浮遊してしまった細胞は足場依存によるシグナルがない状態で、腹を切る覚悟を決め、それを実行した細胞とかんがえると、生理的な機能がだんだんだめになって死ぬという見方とちょっとちがった解釈になると思います。 あと細胞周期にかんしては、止まっているのか進んでいるのは私はわかりませんけど、細胞周期が止まっているという論文などご存じなのでしょうか。ある種のprogramed cell deathはS期に入ることで実行されます。あとなぜM期のまえなんでしょうか。G1アレストはないという根拠があるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2359-15 - 2013/09/17 (火) 15:17:07 - なお >[Re:14] とりあえずさんは書きました : > anoikisを勉強してみては。 > あと、細胞周期が回っていないと細胞が死んでしまう、という先入観にとらわれすぎない方がよいと思いますよ。 神経細胞などのG0期にいる細胞の存在を知っておりますので、そのようには考えておりません。今ここでは足場依存性の株化細胞について伺っております。

(無題) 削除/引用 No.2359-14 - 2013/09/17 (火) 15:11:59 - とりあえず anoikisを勉強してみては。 あと、細胞周期が回っていないと細胞が死んでしまう、という先入観にとらわれすぎない方がよいと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.2359-13 - 2013/09/17 (火) 15:03:00 - なお あと、加えてみなさまに伺いたいのですが、トリプシンではがした細胞では、細胞周期以外の、代謝や膜機能などの生命機能はどうなっていると考えられるのでしょうか？コーティングしていないディッシュにまくとNIH3T3などの株化細胞って増殖できず死んでしまいますよね。でも細胞周期が止まっている（増殖しないとしたら少なくともM期直前で止まっていると考えられる）としても、それ以外の細胞機能が働いていれば、増殖せずにずっと生きていられるような気がするのです。実際にはそうならないということは、接着できない足場依存性細胞は、接着できないと細胞周期だけでなくそれ以外の細胞機能もすべて滞っていると考えてよいのでしょうか？ よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.2359-12 - 2013/09/17 (火) 14:34:12 - なお U2さま、大変お詳しいご説明誠にありがとうございます。 >[Re:10] U2さんは書きました : > FCSにはgrowth factorなどのmitogenが、adultの血清と比べて豊富に含まれていると考えられ、これらのmitogenによりNIH3T3のtransformationが助長される可能性が否定できません。> > transformation自体は、そのようなシグナルの直接的な効果によって起こるというよりは、geneticな変化（oncogeneのmutationや、異倍体化など）を獲得して起こる場合が多いと理解しています。 ここでいう「transformation」というのはoncogeneのmutationや異倍体化することで癌化状態に形質が変化するという解釈でよろしいでしょうか？ またgrowth factorなどのmitogenによりそのような癌化が促進されるというのは、mitogenによって細胞周期の進行が促進されることで、その分DNAの複製エラーやDNA修復ミスなどが起こる頻度やリスクが高まるからという解釈でよろしいでしょうか？ > 通常の培養条件は、oxygenやmitogenなどにより、mutagenicな環境になっていますので、このような変化は避けられません。できるだけearly passageの細胞を使う事でも、このような変化を最小限にする事ができると思います。 ということですが、このearly passageというのはコンフルになる前に早めにpassageをした細胞ということでしょうか？それともpassageの回数が少ない細胞ということでしょうか？前者の解釈であれば、いくらpassageを時間的に早めにしたところで、oxygenやmitogenにさらされている状況に変わりはないし、passageの回数を繰り返していると、いくらコンフルにしたことがないといっても変異は蓄積していくように思うのですが、いかがでしょうか？ あと、経験的にNIH3T3をコンフルになった後もそのままずっと培養していると、細胞が自然とはがれて浮いている細胞が多数出てきます。これまでは、それらの細胞は死んでしまっているからはがれたのだろうと思っていたのですが、みなさまとのやり取りをしているうちに、浮いた細胞は癌化して足場非依存性になったものだったのではと思ってしまいました。この解釈で正しいのでしょうか？ 今度時間があるときにでも一度、浮いた細胞だけを集めて継代し、それらだけでさらに増殖してくるかというのをやってみようと思っています。

(無題) 削除/引用 No.2359-11 - 2013/09/17 (火) 12:17:02 - おお 昔、発癌プロモーターという概念がありました。現在の発癌機構と照らし合わすといろいろな解釈が出て収拾がつかなくなるかもしれませんが、当時はそれ自身では発癌の作用がないが、発癌作用がる要因の発ガン作用を促進するものととらえられていました。PMAは発癌プロモーターの作用があることがしられていましたが、これはPKCを活性化する化学物質でPKCをへてMAP kinase rafカスケードを活性化し細胞増殖を促すさようがあります。 また、炎症の長期化は癌のリスクが高くなることなど(炎症の起こっているところでは、再生などのための増殖も促進されているともいえます、極端な解釈かもしれませんが)、増殖に関与するシグナルは発癌の頻度を上昇させます。 なぜそうなのかといわれると私も勉強不足でわかりませんが、アンバランスな増殖促進は癌化と関係があるようです。 あと3T3をコンフルにすると癌化が促進されるのは、増殖シグナルが、コンタクトインヒビッションという増殖抑制をかいくぐらせようとする作用のためかもしれません。 表面上体裁をととのえてますが、詳しくメカニズムをといわれると、解説できないのが現状です。 ttp://ja.wikipedia.org/wiki/発癌性 ttp://ja.wikipedia.org/wiki/12-O-テトラデカノイルホルボール_13-アセタート ttp://ja.wikipedia.org/wiki/プロテインキナーゼ

(無題) 削除/引用 No.2359-10 - 2013/09/16 (月) 22:49:12 - U2 例えば、oncogenic mutationの入ったRASをNIH3T3に導入すると、足場非依存性の増殖能力を獲得します。その他、様々なoncoproteinの導入により、NIH3T3は足場非依存性の増殖能力を獲得します。逆に、おおさんが書かれているように、この性質を利用してそのようなoncogeneが同定されてきた歴史があります。ゲノム不安定性を増強する蛋白の導入によっても足場非依存性の増殖能が獲得される例があると思います（特にp53の変異体を一緒に導入した場合など）。 FCSにはgrowth factorなどのmitogenが、adultの血清と比べて豊富に含まれていると考えられ、これらのmitogenによりNIH3T3のtransformationが助長される可能性が否定できません。この影響を最小限にするために、細胞増殖をサポートし得る、必要最低限の培地で培養する方が理にかなっていると考える方もいらっしゃるという事です。バッチテストは、例えば、各血清でしばらく継代培養を行った後、コンフルエントの培養でのfoci形成や、アガーの浮遊培養でのコロニー形成の頻度を調べ、それらが最小となる血清を選択する、といった感じです。 Transformationについては、(1)接触阻害がかからなくなる、(2)足場非依存的に増殖する、(3)ヌードマウスに植えると腫瘍を形成する、の３ステップで古典的には評価されてきたと思います。良い状態のNIH3T3細胞は、p19ARFの欠失により不死化しているけれども、上記の３項目のいずれにも当てはまらない状態で維持されていると思います。 良い状態のNIH3T3細胞をコンフルエントで培養すると、接触阻害により増殖が止まります。例えば、その中に、他の遺伝子変異を獲得して接触阻害がかからなくなった細胞が１個混じっていると、コンフルエントの状態ではこの細胞だけが増殖するため、選択的に増えてしまいます。このような事を繰り返すことにより、接触阻害のかからない細胞がドミナントになってしまうという事です。コンフルエントにしなければ、1個混じった変異細胞も、他の細胞も、ほぼ同じ速度で増殖するので、変異細胞がドミナントになるのを防ぐ（あるいは遅らせる）事ができます。 コンフルエントの状態でどのようなシグナルが入るかは、専門外なのでお答えできませんが、transformation自体は、そのようなシグナルの直接的な効果によって起こるというよりは、geneticな変化（oncogeneのmutationや、異倍体化など）を獲得して起こる場合が多いと理解しています。通常の培養条件は、oxygenやmitogenなどにより、mutagenicな環境になっていますので、このような変化は避けられません。できるだけearly passageの細胞を使う事でも、このような変化を最小限にする事ができると思います。 わかりやすく説明するのが苦手で、長々とした返事になってすいません。分からない点については、追加で質問頂ければ、私にお答えできる範囲内でよければ、お答えします。

(無題) 削除/引用 No.2359-9 - 2013/09/15 (日) 19:24:15 - なお >[Re:8] U2さんは書きました : > Primary MEFの継代培養を不死化後も続けると、足場非依存的に増殖する能力を持ったクローンが出てきます。同様にNIH3T3細胞株でも、普通に培養を続けると、足場非依存的に増殖する細胞が出てきます。 足場非依存的な増殖能力は細胞に具体的にどのような変化（特殊なシグナル伝達経路の活性化、あるいはそれによる転写因子の活性化や不活性化、あるいはゲノムレベルの何らかの変化？）が起こることで獲得されるものなのでしょうか？ > 研究者によっては、NIH3T3細胞をtransformしていない状態（あるいは足場依存的な状態）で維持する目的で、FCSではなくバッチテストされたCS（adultのcalf serum）を培養に用いている人もいると思います。 申し訳ございません。研究経験が浅いからかこちらの記述が調べてもよく分かりませんでした。なぜFCSがを用いて培養するとNIH３T3がtransformされた状態になって、バッチテストされたCSだとそうならないのですか？そもそも「NIH３T3のtransformされた状態」というのが分かりません。ご教示頂けないでしょうか。 なおさんがお使いになっているNIH3T3細胞が、既にかなり継代されたものであれば、「足場依存的」な状態を維持しているかどうかは、実際にアガーなどに浮遊させた状態で培養してみないと分からないと思います。 上述の質問とかぶるのですが、コンフルになることで何らかのシグナル経路が働いて、足場非依存的になるというのは何となく想像できそうなのですが、継代を繰り返すことで足場非依存的になるというのはどういったメカニズムなのでしょうか。 質問が多くて申し訳ございませんが、よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.2359-8 - 2013/09/15 (日) 16:11:17 - U2 PrimaryのMEFを一般的な3T3培養で継代すると、ほぼ100%の確率で不死化します。これはp19ARFの欠失か、p53の変異を獲得する事によります。NIH3T3はこの方法で樹立された細胞株で、p19ARFを欠失しており、足場依存的に増殖します。 Primary MEFの継代培養を不死化後も続けると、足場非依存的に増殖する能力を持ったクローンが出てきます。同様にNIH3T3細胞株でも、普通に培養を続けると、足場非依存的に増殖する細胞が出てきます。特にコンフルエントな状態で培養すると、接触阻害のかからないクローンがドミナントになって、足場非依存的な増殖能力を獲得しやすくなります。 研究者によっては、NIH3T3細胞をtransformしていない状態（あるいは足場依存的な状態）で維持する目的で、FCSではなくバッチテストされたCS（adultのcalf serum）を培養に用いている人もいると思います。なおさんがお使いになっているNIH3T3細胞が、既にかなり継代されたものであれば、「足場依存的」な状態を維持しているかどうかは、実際にアガーなどに浮遊させた状態で培養してみないと分からないと思います。

(無題) 削除/引用 No.2359-7 - 2013/09/13 (金) 03:30:52 - おお 関連とぷぴにかきましたが NIH3T3は癌としての性質をもたず、足場依存性です。したがって、ソフトアガーで浮遊した状態にして培養すると増えません。このことを利用して、いろいろな遺伝子を入れて、足場非依存性にトランスフォームすることが可能な遺伝子がスクリーニングされて、がん遺伝子が同定されてきた歴史ある細胞です。 同時にこの細胞は癌化という観点でセンシティビティーが高いせいか、けいだい、維持の仕方によっては自然にトランスフォームしてしまうこともあるようです。なのでこの細胞をつかって癌かの実験をする人は可也気を使って培養しているようです。

(無題) 削除/引用 No.2359-6 - 2013/09/12 (木) 18:37:50 - ~ >浮遊状態でも増殖するMEF株化細胞があるということですか？ いいえ。私は足場非依存性MEF株化細胞があるとは書いていません。 すべてのMEF株化細胞の性質が調べられているということはないでしょう。 また、いかなるMEF株化細胞であっても同じ性質を示すということが証明されることはないでしょう。 そのため、足場非依存性MEF株化細胞の存在を否定することはできません。 >NIH3T3細胞です。 そうであれば、その細胞株について調べられている論文を調べることができますね。 ただ、細胞は継代により性質が変化することがあります。 論文に書かれている性質を維持しているかは、実際に培養評価を行わなければ判定できないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2359-5 - 2013/09/12 (木) 17:43:14 - なお >[Re:4] ~さんは書きました : > 少なくとも、浮遊状態では増殖しないMEF株化細胞はあります。 > ただ、それはいかなるMEF株化細胞であっても浮遊状態で増殖しないことを意味しません。 浮遊状態でも増殖するMEF株化細胞があるということですか？そもそもMEF株化細胞に複数種類があることを知らず、今調べてみたのですが、そのようなことが載っているサイトや文献が見当たりません。よろしければご教示頂けないでしょうか。 > なおさんがどのMEF株化細胞の話をしているのかを確認しましょう。 NIH3T3細胞です。

(無題) 削除/引用 No.2359-4 - 2013/09/12 (木) 17:23:29 - ~ >もしはがれている状態でも細胞周期が回って増殖できているなら その性質を持っているのであれば、足場非依存性ですね。 >MEF株化細胞ははがれた状態でも分裂、増殖できるものなのでしょうか？ 少なくとも、浮遊状態では増殖しないMEF株化細胞はあります。 ただ、それはいかなるMEF株化細胞であっても浮遊状態で増殖しないことを意味しません。 なおさんがどのMEF株化細胞の話をしているのかを確認しましょう。

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